短梗霉素A對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長(zhǎng)機(jī)理（二）
2、結(jié)果與分析
2.1 AbA敏感性測(cè)定
結(jié)果表明，野生株Bc AUR1在2μg/m L Ab A的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng);Ab A為8μg/m L時(shí)，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制;當(dāng)Ab A濃度達(dá)到50μg/m L時(shí)，未見(jiàn)菌體生長(zhǎng)(圖2)。突變株Bc AUR1a在Ab A濃度為2～50μg/m L的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)(圖2)，表明突變菌株Bc AUR1a對(duì)Ab A產(chǎn)生了抗性。
圖2灰葡萄孢菌對(duì)AbA敏感性測(cè)定
2.2突變株Bc AUR1a對(duì)Ab A處理柑橘的侵染
2.5%甲醇處理的對(duì)照組柑橘全部被野生株Bc AUR1感染(圖3a)，50μg/m L Ab A處理的試驗(yàn)組柑橘均未被野生株Bc AUR1感染(圖3b)，說(shuō)明Ab A抑制了野生株Bc AUR1對(duì)柑橘的侵染，能夠有效防治柑橘灰霉病的發(fā)生。而突變株Bc AUR1a則對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組柑橘都能侵染(圖3c～d)，說(shuō)明Ab A不能抑制突變株BCAUR1a對(duì)柑橘的侵染，突變株Bc AUR1a產(chǎn)生了Ab A抗性。
圖3 AbA對(duì)灰葡萄孢菌侵染柑橘的影響
2.3 Ab A對(duì)灰葡萄孢細(xì)胞形態(tài)的影響
未經(jīng)Ab A處理的灰葡萄孢Bc AUR1細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞壁表面界限和表面物質(zhì)清晰可見(jiàn);細(xì)胞質(zhì)膜平滑連續(xù)，緊貼細(xì)胞壁;內(nèi)膜系統(tǒng)豐富，線粒體膜完整，嵴豐富而粗壯，液泡膜完整，細(xì)胞質(zhì)中富含糖原顆粒(圖4a～b)。在8μg/m L的Ab A作用下，細(xì)胞明顯變小，細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜表面粗糙不平，皺縮明顯，部分質(zhì)膜和液泡膜破裂;內(nèi)膜系統(tǒng)的部分膜界限不清晰，線粒體腫脹，糖原顆粒和細(xì)胞內(nèi)容物顯著減少(圖4c～f)。表明Ab A抑制了IPC合成酶的活性，導(dǎo)致鞘脂類合成代謝受阻，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重影響，質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)形態(tài)異常，發(fā)生褶皺甚至破裂，造成細(xì)胞內(nèi)糖原和內(nèi)容物泄漏。
圖4灰葡萄孢菌細(xì)胞形態(tài)的透射電鏡
3、討論
Ab A能抑制多種真菌的生長(zhǎng)，對(duì)假絲酵母(Candida)、曲霉(Aspergillus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等病原真菌均有抑制作用。我們通過(guò)Ab A對(duì)灰葡萄孢菌野生株BcAUR1及其AUR1基因但內(nèi)含子缺失的突變株Bc AUR1a抑制作用的研究，也證實(shí)低濃度Ab A(8μg/m L)能夠顯著抑制灰葡萄孢菌野生株Bc AUR1的生長(zhǎng)，高濃度Ab A(50μg/mL)則完全抑制其生長(zhǎng)，但突變株Bc AUR1a則不受Ab A的影響，在高濃度Ab A存在下亦能正常生長(zhǎng)。灰葡萄孢菌感染柑橘的試驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果。這些結(jié)果均表明Ab A通過(guò)抑制IPC合成酶的活性，導(dǎo)致鞘脂合成不足，從而抑制了灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)中突變株BcAUR1a是AUR1基因中缺失內(nèi)含子，產(chǎn)生了AbA抗性，抵抗Ab A對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的抑制，說(shuō)明該內(nèi)含子可能在AUR1基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，目前已有許多研究表明內(nèi)含子具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，在其序列中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，起著啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和抑制子的作用。
鞘磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分，特別是生物膜脂筏(lipid raft)結(jié)構(gòu)中的主要物質(zhì)，鞘磷脂還與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞、胞飲等密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Ab A導(dǎo)致灰葡萄孢細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)形態(tài)異常，質(zhì)膜和液泡膜斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露，從而抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步證實(shí)了Ab A使神經(jīng)酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺的反應(yīng)受阻，導(dǎo)致鞘磷脂類物質(zhì)的合成量不足，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成糖原等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露。
綜上所述，Ab A抑制絲狀真菌生長(zhǎng)的機(jī)理是抑制了IPC合成酶的活性，導(dǎo)致鞘磷脂類物質(zhì)的合成不足，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏。
短梗霉素A對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長(zhǎng)機(jī)理（一）
短梗霉素A對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長(zhǎng)機(jī)理（二）
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