短梗霉素A對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長(zhǎng)機(jī)理（一）
通過(guò)考察短梗霉素A(Ab A)對(duì)灰葡萄孢菌野生株Bc AUR1及其AUR1基因內(nèi)含子缺失突變株Bc AUR1a生長(zhǎng)的影響，明確Ab A抑制真菌生長(zhǎng)的機(jī)理。Ab A敏感性試驗(yàn)表明，低濃度Ab A(8μg/m L)顯著抑制野生株Bc AUR1菌體的生長(zhǎng)，高濃度Ab A(50μg/mL)存在下觀察不到Bc AUR1的生長(zhǎng)跡象。突變株Bc AUR1a則不受Ab A的影響，在低濃度和高濃度Ab A存在下均能正常生長(zhǎng)。Ab A抑制Bc AUR1侵染柑橘果實(shí)，但Bc AUR1a在高濃度Ab A存在下也能夠有效感染柑橘果實(shí)。這兩個(gè)試驗(yàn)均證實(shí)了突變株Bc AUR1a具有Ab A抗性。電鏡觀察表明，Ab A引起B(yǎng)c AUR1細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)形態(tài)異常，質(zhì)膜和液泡膜斷裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露。Ab A抑制灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的機(jī)制是由于IPC合成酶受到抑制，導(dǎo)致鞘磷脂類物質(zhì)合成不足，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)外漏。
灰霉病由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起，是一種世界范圍內(nèi)的農(nóng)作物及果蔬病害。灰葡萄孢菌的寄主范圍很廣，能侵染多種糧食作物、蔬菜、水果和觀賞植物的葉、莖、花和果實(shí)。灰霉病不僅在田間造成危害，而且在貯運(yùn)、銷售和消費(fèi)期間繼續(xù)造成果蔬發(fā)病腐爛，嚴(yán)重影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前化學(xué)防治仍然是灰霉病防治的主要措施，但由于灰葡萄孢菌具有遺傳變異大、繁殖速率快和適應(yīng)性強(qiáng)等特性，連續(xù)多年大量使用單一作用位點(diǎn)的殺菌劑，很容易形成對(duì)特定殺菌劑具有抗性的亞群體，其結(jié)果是防治效果下降，甚至失效。灰葡萄孢菌主要侵染果蔬的可食部分，殺菌劑的廣泛使用，帶來(lái)各種問(wèn)題，如農(nóng)藥殘留導(dǎo)致人畜安全受到威脅，傷害環(huán)境中其他微生物引起生態(tài)平衡失調(diào)等。人們一直試圖尋找一種對(duì)真菌高效、與已有藥劑沒(méi)有交互抗性、對(duì)人類安全的新型殺菌劑。
鞘脂是真核生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要成分，是維持真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)不可缺少的組分。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，鞘脂及其代謝產(chǎn)物還是重要的信號(hào)分子，參與膜蛋白的定位和運(yùn)輸，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、衰老等基本生命活動(dòng)。在鞘脂合成途徑中，哺乳動(dòng)物鞘脂類合成最終形成鞘磷脂，植物中形成復(fù)雜神經(jīng)鞘脂質(zhì)，而真菌最終形成甘露糖基化的肌醇磷酸神經(jīng)酰胺。因此，神經(jīng)酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺(IPC)和甘油二酯的反應(yīng)是真菌鞘脂合成所特有的(圖1)。催化這一反應(yīng)的酶，肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶(IPC合成酶)是鞘脂代謝中的關(guān)鍵酶，可作為篩選抗真菌藥物的靶標(biāo)。
圖1不同生物中鞘脂代謝途徑
短梗霉素A(aureobasidin A，Ab A)是從出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)R106培養(yǎng)液中分離得到的環(huán)狀九肽抗生素，對(duì)真菌和原生動(dòng)物的生長(zhǎng)有廣譜抑制作用。現(xiàn)已證實(shí)Ab A是真菌AUR1基因編碼的IPC合成酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。Ab A處理和AUR 1基因表達(dá)抑制均引起酵母細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)變化，如微管消失、細(xì)胞周期循環(huán)阻滯，細(xì)胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)完整性遭到破壞等。通過(guò)在酵母等真菌中篩選抗Ab A突變體，發(fā)現(xiàn)突變體能抵抗Ab A引起的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育的異常，酵母AUR1基因158位的苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)槔野彼?Tyr)是獲得Ab A抗性的分子機(jī)制。
迄今，對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用了解甚少，本試驗(yàn)通過(guò)研究Ab A對(duì)灰葡萄孢菌及其突變體生長(zhǎng)的影響，明確Ab A抑制真菌生長(zhǎng)的機(jī)理，為真菌的防治和開(kāi)發(fā)新型抗真菌藥物提供理論依據(jù)。
1、材料與方法
1.1供試材料
1.1.1菌株
灰葡萄孢菌原始菌株Bc AUR1由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院李紅葉教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。灰葡萄孢菌突變菌株Bc AUR1a由本實(shí)驗(yàn)室以Bc AUR1為原始菌株，通過(guò)紫外誘變，Ab A篩選獲得，經(jīng)鑒定和序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該突變菌株AUR 1基因序列中缺失117～231位115 bp的內(nèi)含子序列，但AUR1基因編碼的IPC合成酶的氨基酸序列未發(fā)生突變。
1.1.2培養(yǎng)基和Ab A母液配制
含Ab A的PDA培養(yǎng)基：待滅菌PDA培養(yǎng)基涼至50℃，依次加入Amp(終濃度為100μg/m L)和Ab A，使Ab A終濃度分別為2、8和50μg/m L，混勻后鋪板;以相應(yīng)濃度的甲醇代替Ab A，作為對(duì)照PDA培養(yǎng)基。
Ab A母液：Ab A購(gòu)自寶生物公司，用甲醇配成濃度為2 mg/m L的母液，存儲(chǔ)在4℃冰箱中，備用。
其他所有試劑均為分析純。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1灰葡萄孢菌的培養(yǎng)
保存菌種用平板畫線法接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫倒置培養(yǎng)一周，待其菌絲變?yōu)榛疑a(chǎn)生孢子，無(wú)菌水洗下孢子，調(diào)整孢子的濃度為1×107個(gè)/m L，4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.2灰葡萄孢菌對(duì)Ab A的敏感性測(cè)定
將野生型灰葡萄孢菌及其突變體的孢子懸浮液分別取100μL接種于對(duì)照平板和含不同濃度Ab A的PDA平板上培養(yǎng)6 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。
1.2.3灰葡萄孢菌侵染柑橘試驗(yàn)
先用清水將柑橘表面洗干凈，然后在超凈臺(tái)中依次用無(wú)菌水、70%乙醇清洗，晾干。將柑橘分為4組，每組10個(gè)。用無(wú)菌針在柑橘表皮上刺1個(gè)1 mm左右的傷口，試驗(yàn)組在傷口表面均勻涂布5μL 50μg/m L的Ab A，晾干。對(duì)照組均勻涂布5μL2.5%甲醇。分別將5μL Bc AUR1和Bc AUR1a的孢子懸液(1×107個(gè)/m L)均勻涂布于對(duì)照組和試驗(yàn)組柑橘傷口處，置于保濕器皿中，室溫(20±2)℃下培養(yǎng)4 d，觀察感染情況。
1.2.4 Ab A對(duì)灰葡萄孢菌細(xì)胞形態(tài)的影響
分別將灰葡萄孢菌Bc AUR1孢子懸液接種于含8μg/m L Ab A的PDA平板和對(duì)照平板上，25℃培養(yǎng)3 d。用2.5%的戊二醛溶液4℃固定過(guò)夜，按常規(guī)透射電鏡樣品制備方法制備樣品。將制備好的樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片，獲得70～90 nm的薄片，經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色15 min后，在日本JEOL公司生產(chǎn)的JEM-1230型透射電鏡中觀察、拍照。
短梗霉素A對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長(zhǎng)機(jī)理（一）
短梗霉素A對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長(zhǎng)機(jī)理（二）
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