生長(zhǎng)延滯期是什么意思？微生物生長(zhǎng)延滯期檢測(cè)方法
食源性疾病是全球最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，引發(fā)食源性疾病的物質(zhì)包括病原微生物、寄生蟲(chóng)、天然毒素以及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)等，其中由食源性致病菌引起的食源性疾病是全球食品安全面臨的最重要挑戰(zhàn)之一。近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)食源性致病菌的關(guān)注度持續(xù)上升，關(guān)于中國(guó)食品中食源性致病菌的檢出情況也有較多報(bào)道。2000—2014年，我國(guó)暴發(fā)的食源性疾病中一半以上是因?yàn)槭秤弥虏【廴镜氖称范鸬摹Ｏ噍^于物理及化學(xué)污染物，食源性致病菌引發(fā)的食品安全事件暴發(fā)率更高。針對(duì)此類食品安全問(wèn)題，在食品工業(yè)中應(yīng)采取更有效的措施來(lái)控制食品中致病菌的污染水平，并估算其在不同食品加工及流通條件下的生長(zhǎng)參數(shù)，以降低因食源性致病菌引發(fā)的食源性疾病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。
在食源性致病菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)研究中，生長(zhǎng)延滯期與最大比生長(zhǎng)速率是兩個(gè)重要的生長(zhǎng)參數(shù)。相較于最大比生長(zhǎng)速率，生長(zhǎng)延滯期更難定義和準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，且微生物群體與單細(xì)胞水平下的生長(zhǎng)延滯期概念與測(cè)定方法也并不相同。因此，為更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)生長(zhǎng)延滯期，研究影響其變化的相關(guān)因素至關(guān)重要。此外，通過(guò)基于實(shí)驗(yàn)的觀測(cè)結(jié)果結(jié)合預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型來(lái)計(jì)算生長(zhǎng)延滯期的方法已被廣泛研究，而對(duì)生長(zhǎng)延滯期中胞內(nèi)相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化及其對(duì)食源性致病菌生長(zhǎng)的影響研究鮮少，研究相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化有利于從機(jī)理出發(fā)進(jìn)一步準(zhǔn)確地描述生長(zhǎng)延滯期，并且有助于評(píng)估模型預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此值得深入探討。
目前，如何準(zhǔn)確預(yù)測(cè)食源性致病菌生長(zhǎng)延滯期已成為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。本文首先對(duì)生長(zhǎng)延滯期的檢測(cè)方法進(jìn)行歸整和分析，并重點(diǎn)介紹生長(zhǎng)延滯期的影響因素及可作為生長(zhǎng)延滯期生理標(biāo)記的相關(guān)胞內(nèi)活動(dòng)，最后對(duì)生長(zhǎng)延滯期研究的發(fā)展趨勢(shì)提出建議，以期對(duì)食源性致病菌的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)管理控制提供一定的理論支持。
1、生長(zhǎng)延滯期
生長(zhǎng)延滯期在生物學(xué)上被普遍接受的定義為：微生物群體適應(yīng)新環(huán)境的時(shí)間。延滯期之后細(xì)胞群體將開(kāi)始分裂繁殖；而在微生物典型的S型生長(zhǎng)曲線中，生長(zhǎng)延滯期的幾何定義為：微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率時(shí)，生長(zhǎng)曲線切線的反向延長(zhǎng)線和初始菌量水平延長(zhǎng)線的交點(diǎn)在時(shí)間軸上的投影點(diǎn)與零時(shí)刻的時(shí)間間隔。這也是目前預(yù)測(cè)微生物學(xué)建模中計(jì)算生長(zhǎng)延滯期最常用的方法。微生物單細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期指的是單個(gè)細(xì)胞到達(dá)第一次分裂所需的時(shí)間，該時(shí)間段包括損傷修復(fù)及合成某種必需分子激發(fā)分裂的時(shí)間。無(wú)論是食源性致病菌的群體還是單細(xì)胞，對(duì)其生長(zhǎng)延滯期的控制均有利于降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)，數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)致病菌生長(zhǎng)的準(zhǔn)確性很大程度上也取決于該模型對(duì)延滯期的預(yù)測(cè)能力，因此更好地理解生長(zhǎng)延滯期并將其涉及的生理學(xué)知識(shí)納入預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型中，對(duì)該模型在食品安全與質(zhì)量管理中的有效應(yīng)用具有重要意義。由于目前關(guān)于生長(zhǎng)延滯期過(guò)程中涉及的相關(guān)生理過(guò)程（如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等角度）并未完全了解，并且微生物的本質(zhì)屬性及環(huán)境作用共同決定了細(xì)胞個(gè)體的生理狀態(tài)，因此需從機(jī)理角度出發(fā)進(jìn)一步準(zhǔn)確地定義生長(zhǎng)延滯期。
2生長(zhǎng)延滯期的檢測(cè)方法
目前微生物生長(zhǎng)延滯期是通過(guò)建立生長(zhǎng)曲線并結(jié)合預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型計(jì)算獲得，而生長(zhǎng)曲線的獲取需要足夠多且有效的數(shù)據(jù)點(diǎn)，因此生長(zhǎng)延滯期的測(cè)定方法依賴于微生物細(xì)胞的定量方法。傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法是獲取微生物群體生長(zhǎng)數(shù)據(jù)的最主要手段，而此法耗時(shí)較長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)無(wú)法實(shí)時(shí)獲取。相比之下，比濁法因其操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)被較多應(yīng)用于微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和建模研究中。然而由于比濁法具有檢測(cè)限高（106～107CFU/mL）、適用范圍窄（只可用于液體基質(zhì)的測(cè)定）等不足而導(dǎo)致獲得的生長(zhǎng)延滯期存在一定偏差。隨著微生物定量技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、數(shù)字PCR、變性梯度凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)及生物傳感器等技術(shù)被應(yīng)用于預(yù)測(cè)微生物學(xué)的研究中，這些技術(shù)具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，改善了傳統(tǒng)方法的不足，具有良好的發(fā)展前景。表1總結(jié)了可應(yīng)用于測(cè)定食源性致病菌生長(zhǎng)延滯期的相關(guān)技術(shù)。
表1可應(yīng)用于測(cè)定食源性致病菌生長(zhǎng)延滯期的微生物定量方法
單細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期的測(cè)定不同于群體細(xì)胞，單細(xì)胞生長(zhǎng)具有較大變異性，因此需獲取大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以體現(xiàn)其真實(shí)性。獲取單細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期最直接的方法是通過(guò)顯微鏡觀察單細(xì)胞的分裂過(guò)程，顯微觀測(cè)法從1932年Kelly等在顯微鏡下觀察到微生物單細(xì)胞分裂過(guò)程后得到快速的發(fā)展。然而，由于觀測(cè)視野中多個(gè)細(xì)胞連續(xù)分裂導(dǎo)致子代細(xì)胞很快布滿視野，因此大多數(shù)基于此方法的研究也只能觀測(cè)到細(xì)胞分裂2次或3次，不利于對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)觀測(cè)。為解決這一缺陷，Elfwing等設(shè)計(jì)配有生長(zhǎng)流動(dòng)槽裝置的顯微觀測(cè)系統(tǒng)，此方法可通過(guò)提高流動(dòng)液體流速將分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞沖走，使得目標(biāo)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖不會(huì)受到子代細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，同時(shí)采用低倍暗視野顯微鏡拍攝，能夠在同一批次的實(shí)驗(yàn)中獲得大量單細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微生物單細(xì)胞生長(zhǎng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)，且通過(guò)改變流動(dòng)液體環(huán)境還能夠研究不同條件下單細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律。基于以上優(yōu)點(diǎn)，流動(dòng)槽裝置已在許多單細(xì)胞的研究中得到應(yīng)用。隨著顯微觀測(cè)與計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)結(jié)合熒光來(lái)觀測(cè)單細(xì)胞生長(zhǎng)已成為顯微觀測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)之一，如激光掃描顯微鏡已被應(yīng)用于觀測(cè)熒光介導(dǎo)的單細(xì)胞生長(zhǎng)分析中。此外，采用流式細(xì)胞儀結(jié)合不同的熒光染料也能獲取單細(xì)胞的生理指標(biāo)參數(shù)，如細(xì)胞膜完整性（可用熒光強(qiáng)度表征）、膜表面電位及胞內(nèi)pH值等，然而此方法不能連續(xù)地監(jiān)測(cè)單細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂過(guò)程。近年來(lái)，為長(zhǎng)時(shí)間有效地監(jiān)測(cè)微生物單細(xì)胞在特定環(huán)境中的生長(zhǎng)行為，單細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)芯片技術(shù)成為眾多研究的焦點(diǎn)，如在此基礎(chǔ)上研發(fā)的能夠觀測(cè)單細(xì)胞生長(zhǎng)的微流體裝置。除直接觀測(cè)單細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂外，檢測(cè)時(shí)間法是間接推算單細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期的最常用方法，即通過(guò)全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定由初始吸光度增加至菌液濃度為106～107CFU/mL時(shí)對(duì)應(yīng)吸光度所需要的檢測(cè)時(shí)間。表2總結(jié)了應(yīng)用不同方法測(cè)定單細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期的相關(guān)研究。
表2應(yīng)用不同方法測(cè)定單細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期的相關(guān)研究
綜上所述，在食源性致病菌生長(zhǎng)延滯期的測(cè)定中，群體水平上以傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法為基礎(chǔ)的測(cè)定方法具有選擇性，且在實(shí)際操作中費(fèi)時(shí)費(fèi)力。新型的微生物定量方法具有較好的應(yīng)用前景，但每種方法都有自己的優(yōu)勢(shì)和弊端，食品基質(zhì)、致病菌的數(shù)量也均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此需持續(xù)開(kāi)發(fā)微生物定量新技術(shù)，以滿足檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、成本更低、檢測(cè)時(shí)間更短的要求。單細(xì)胞觀測(cè)方法上的創(chuàng)新是更加準(zhǔn)確地獲取大量且有效的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)的前提。在未來(lái)的研究中應(yīng)多關(guān)注于群體細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期及單細(xì)胞分裂所涉及的機(jī)理，并基于此而更加明確生長(zhǎng)延滯期的定義，從而建立更快速、更準(zhǔn)確的測(cè)定方法。
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