高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌的構建方法及應用
L-高絲氨酸(Homoserine，2-Amino-4-hydroxybutyricacid)，是一種非蛋白氨基酸。可用于蛋氨酸、蘇氨酸、胱硫醚、L-高絲氨酸內酯、γ-丁內酯、1,4-丁二醇、O-乙酰高絲氨酸與手性除草劑L-草胺膦等化學物質的生產，是一種極具潛力的中間體。L-高絲氨酸及其衍生物具有豐富的的生物活性，例如可提高植物的抗逆性，促進家禽生長，還可以有效地抑制鐮狀紅細胞、并作為抗真菌藥物，當前L-高絲氨酸的生產方法包括化學合成法、化學手性拆分法和生物法。
目前，化學合成法、化學手性拆分法和生物法來生產L-高絲氨酸，其中化學合成法使用的原料比較容易獲得，收率較高，但是提純步驟較為復雜，反應時間長，而化學手性拆分法指在混旋的高絲氨酸溶液中，加入手性試劑進行反應，使L/D-高絲氨酸性質發生差異，從而分離出L-高絲氨酸。該方法產率較低，由于在該過程中加入了大量的有機溶劑，因此會產生較大的污染，上述兩種生產制備L-高絲氨酸的方式都存在較大弊端，隨著微生物代謝工程的快速發展，在氨基酸工業生產中涌現大量以葡萄糖為原料的生產菌株，通過通過調控分支途徑、不斷優化合成代謝流、調節輔因子水平，以提高無質粒、非營養缺陷型菌株產量，但是通過生物方式生產L-高絲氨酸所采用的大腸桿菌Escherichia coli dh5aα由于在發酵中容易導致乙酰輔酶A的積累，使得檸檬酸循環的物質輸入減少，且對乙酰輔酶A的利用能力較低，最終導致發酵生產的L-高絲氨酸的產量較低。
因此，為了解決上述技術問題本申請提出一種高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌的構建方法及應用。
一種高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌的構建方法操作步驟：
A：構建基因工程菌大腸桿菌，得到高產菌株Escherichia coli dh5aα，其具體的構建步驟為；
A1：使用菌株CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除了旁路代謝的相關基因(metB、thrB、metA、lysA)和調節基因(metJ)；
A2：將metL基因的天然啟動子替換為Trc啟動子，并且敲除轉運基因metI構建得到了高產菌株Escherichia coli dh5aα；，
B：通過將ppc基因(編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的天然啟動子替換為Trc啟動子，再通過質粒過表達了突變基因pyccg P458S(pyc*)，基因ppc和pyc*分別編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶，這兩種酶可以減少乙酰輔酶A積累，增加檸檬酸循環的物質輸入；
通過過表達thrAC1034T(thrA*)和lysCcg C932T(lysC*)基因，thrA*編碼抗反饋抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ和高絲氨酸脫氫酶Ⅰ融合蛋白，lysC*編碼抗反饋抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ，thrA*和lysC*的過表達將提高產物的合成速率，能減少草酰乙酸、檸檬酸等副產物的積累；
C：敲除乙醛酸途徑轉錄調控因子基因iclR來強化乙醛酸循環，從而來強化菌株對乙酰輔酶A的利用能力，隨后外源導入了蔗糖代謝基因，提高高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌利用蔗糖的發酵能力，通過以上步驟，得到高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株；
需要說明的是，根據權利要求1所述的高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株發酵L-高絲氨酸的應用具有如下步驟；
D：對高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株進行菌種活化以及培養種子液，并將培養好的種子液以體積濃度5％的接種量接種至5L發酵罐發酵培養基上；
E：將活化完成后的高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株接種至發酵培養基，在30℃、200rpm條件下發酵培養，將培養液分離純化，獲得L-高絲氨酸，并且為了在發酵過程中防止菌體污染，在培養基中添加了少量抗生素，并且為了提高L-高絲氨酸工程菌的生產性能，可通過加強更短、轉化率更高的合成路徑、優化中心代謝途徑、調節輔因子水平、加快菌株生長等策略實現，其中需要說明的是，為了保障高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株的活性，在進行種子培養時，需將高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株暫存于-80℃的環境中；
通過以上步驟，使用經過改造后的重組大腸桿菌相比于野生型能夠更好地利用葡萄糖等碳源物質進行L-高絲氨酸的生產，并且能力更強，轉化率更高；請參閱圖2所示，經過改造后得到的性能最優的菌株在發酵生產L-高絲氨酸方面的水平相比于野生型有明顯提升，5L罐發酵水平從32.17g/L提升至60.87g/L，產率提高了89.21％，并且由工程菌dh5aα的發酵生長曲線可知，在發酵32h后L-高絲氨酸產量最大，發酵產生的L-高絲氨酸的產量相較于通常情況下，生產效率更高，具有良好的應用推廣價值；
在該方案的其中一個實施例中，對高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株進行菌種活化和種子液的培養方法分為如下步驟進行；
D1：將高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株接種在LB固體培養基平板上，在37℃培養箱中培養24h，實現對高產L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株的活化操作，其中LB固體培養基平板的具體結構成分為蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L，溶劑為去離子水，pH值自然。LB平板是在LB液體培養基中添加終濃度2g/L瓊脂；
D2：挑取LB平板上長勢較好的單菌落接種至LB液體培養基中，在37℃、200rpm的搖床中培養24h，獲得種子液；
其中，所述5L發酵罐發酵培養基的具體物質組成包括葡萄糖40g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸銨17g/L、酵母粉4g/L、碳酸鈣20g/L、L-蘇氨酸0.20g/L、L-蛋氨酸0.2g/L、維生素B1 0.0001g/L、維生素B1 20.000g/L、L-異亮氨酸0.2g/L、MgSO4 2g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/L，去離子水1000mL，pH值為6.8，將適量經斜面培養基活化后的菌體細胞接種至裝有2.5L種子培養基的5L發酵罐，流加氨水調節發酵液pH 6.8～7.2，溶氧維持20％～40％，通風量2～4m3/h，攪拌轉速200～800r/min，35℃培養6h。以10％接種量將種子培養物接至裝有3L發酵培養基的5L發酵罐進行發酵培養，發酵溫度35℃，通風量2～4m3/h，攪拌轉速300～900r/min，溶氧維持在20％～50％，流加80％的葡萄糖溶液，維持殘糖質量濃度為1～3g/L，流加氨水調節發酵液pH6.8～7.2，發酵周期52h。利用H-10發酵時，接種后加入終濃度為0.05mmol/L的IPTG；
在發酵完成后，通過生物傳感器分析儀測定葡萄糖含量。生物量以OD600nm計。采用高效液相色譜柱前衍生法測定L-高絲氨酸濃度。樣品用2,4-二硝基氟苯衍生，以乙腈-水混合液(1∶1，V/V)和50mmol/L乙酸銨溶液為流動相，以1mL/min的流速梯度混合經過C18AAA色譜柱分離，最后在360nm波長處進行檢測。
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