順-6-十八碳烯酸在制備抗真菌藥物之真菌生長曲線的測定
近年來，隨著癌癥患者、器官移植接受者、老年患者等免疫功能低下人群的不斷增加，侵襲性真菌感染(Invasive Fungal Infections，IFIs)的發(fā)病率和死亡率日漸攀升。侵襲性念珠菌感染(Invasive Candidiasis，IC)在IFIs中占主要地位，其死亡率粗略估計已高于40％，這其中又以白念珠菌(Candida albicans)為主要感染菌株。白念珠菌除了能以酵母態(tài)和菌絲態(tài)引起人體淺部和深部真菌感染以外，還能通過形成結(jié)構(gòu)致密的生物被膜附著在內(nèi)臟表面或生物材料的表面，難以清除，造成反復(fù)感染。目前臨床上常用的抗真菌藥物包括唑類、多烯類、棘白菌素類、丙烯胺類等，隨著傳統(tǒng)藥物的經(jīng)年使用，臨床上真菌耐藥的現(xiàn)象日益增多，這也成為真菌感染治療失敗的主要原因之一。除此之外，傳統(tǒng)抗真菌藥物或多或少存在著毒性大、有效率低、價格昂貴等問題，難以滿足人類健康的需求，亟需開發(fā)高效、低毒的新型抗真菌藥物。
順-6-十八碳烯酸(Petroselinic Acid，下文中全部使用PeAc代表順-6-十八碳烯酸)是存在于芫荽、胡蘿卜等植物中的不飽和脂肪酸。
已有研究顯示：PeAc能調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌菌群(Genes.2022；13(11):1967.)。PeAc是牙齦卟啉單胞菌的殺菌劑，是植物提取物防治牙周疾病的主要有效成分(Microbiol.2022；13:816047.)。PeAc能抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的生物被膜)，PeAc還能抑制金黃色葡萄球菌毒力因子的產(chǎn)生(Microbiologyspectrum.2022；10(3):e0133022.)。PeAc能減輕腸缺血/再灌注損傷小鼠的腸道損傷并減少細(xì)胞凋亡(British journal of anaesthesia.2022；128(3):501-12.)。真菌界(eumycetes)是生物的一界，是一大類高等真核生物，與細(xì)菌完全不同，以上報道多為PeAc抗病原細(xì)菌的研究報道，而本發(fā)明中涉及的PeAc抗病原真菌的研究，目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)報道。
單倍體不足效應(yīng)分析(haploinsufficiency profiling，HIP)是行之有效的發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物靶標(biāo)的方法之一。文獻(xiàn)報道二倍體的真菌在缺失了一個編碼藥靶的等位基因后基因劑量(gene dose)減半，該藥靶基因缺失菌對藥物的敏感性大幅度上升，這種現(xiàn)象被稱為單倍體不足效應(yīng)。研究人員可以通過構(gòu)建基因敲除菌庫，利用單倍體不足效應(yīng)篩選對藥物敏感的基因敲除菌，從而鑒定出藥靶。2014年Science曾報道利用釀酒酵母基因敲除菌庫鑒定出了氟康唑的藥靶Erg11p和他莫西芬的藥靶Neo1p(Science.2014；344(6180):208-11)。科學(xué)家還利用單倍體不足效應(yīng)明確了Turbinmicin抗真菌的藥靶是Sec14p(Science.2020；370(6519):974-8)，F(xiàn)901318抗真菌的藥靶是二氫乳酸脫氫酶(DHODH)(Proc Natl Acad Sci U S A.2016；113(45):12809-14)，化合物G884、G365抗真菌的藥靶是Gwt1p(ACS Infect Dis.2015；1(1):59-72)等。
真菌生長曲線的測定
白念珠菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)16h。吸取活化好的菌液至1.5ml離心管中，于3000g離心1min，吸棄培養(yǎng)基后用PBS洗一次，離心棄上清，用1ml PBS重懸，稀釋后取10μl至血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。在開始培養(yǎng)前，取未經(jīng)稀釋的原菌液于96孔板第一列A1-C1孔中(三復(fù)孔)，200μl/孔，第2-10列各孔分別加入100μl RPMI 1640液體培養(yǎng)基，從第一列開始倍比稀釋至第10列，測量各孔OD630，并根據(jù)各孔不同的OD630
值(x)及其相對應(yīng)的菌濃度(y)作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后用RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋并調(diào)整菌液濃度至1×106cells/ml。將菌液分成數(shù)份，轉(zhuǎn)移至50ml離心管，每管10ml。每管菌液中分別加入不同濃度(2、4、8μg/ml)的待測藥物PeAc，隨后在加入2μg/ml PeAc的幾個管中又分別加入不同濃度(4、16、64μg/ml)的FLC，4、8μg/ml PeAc的幾個管中進(jìn)行同樣的操作。最后剩余3管，一管只加8μg/mlPeAc，一管只加64μg/ml FLC，一管不加藥。所有含菌液的離心管于30℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，以200rpm振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、8和12h時在各組菌液中吸取100μl于96孔板中(取之前渦旋混勻各管菌液)測各孔的OD630，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的方程計算各組不同培養(yǎng)時間節(jié)點的菌濃度，并以log10 CFU/ml對時間作曲線。實驗結(jié)果見下圖，PeAc與氟康唑聯(lián)用抗耐藥真菌的量效關(guān)系的測定結(jié)果示意圖。
結(jié)果顯示，單用氟康唑(64μg/ml)或者單用PeAc(8μg/ml)8h后有顯示出一定的抑制白念珠菌生長的作用，12h后抑制作用則迅速減弱，白念珠菌生長情況與對照組接近。當(dāng)固定PeAc濃度為2μg/ml時，與4、16、64μg/ml氟康唑合用，發(fā)現(xiàn)隨氟康唑濃度的升高，兩藥協(xié)同對耐藥菌的抑制作用也增加，但組內(nèi)的抑制效果差異并不明顯。而隨著PeAc濃度的增加，兩藥合用的抑制耐藥菌生長的能力也逐漸加強，尤其是當(dāng)PeAc濃度達(dá)到8μg/ml時，與4、16、64μg/ml氟康唑合用，發(fā)現(xiàn)兩藥合用抑制耐藥菌生長效果顯著，組內(nèi)的抑制效果差異明顯，尤其是“PeAc 8μg/ml+FLC 64μg/ml”的組合使耐藥菌的生長抑制在較低水平。因此，兩藥合用協(xié)同抗真菌的作用與PeAc的量效關(guān)系更明顯。
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