不同碳源、氮源和金屬離子對耐鋅菌株的生長特性的影響（二）
2結果與分析
2.1耐鋅菌株HXZ-1的篩選
樣品經過多次馴化培養后，吸取適量菌液稀釋涂布于含有800 mg/L ZnCl2的固體LB培養基上，于30℃下培養48 h，得到一株長勢良好的菌株，編號為HXZ-1，在LB固體平板上生長24 d后形成乳黃色、不透明、邊緣整齊、表面隆起、濕潤光滑、易挑起的圓形菌落(如圖1-A和1-B)，革蘭氏染色為陽性(如圖1-C)，無鞭毛，不運動，不產芽孢。
2.2不同鋅離子濃度對菌株HXZ-1生長的影響
通過菌株HXZ-1在不同濃度的鋅離子液體培養基中的生長狀況，了解菌株對不同鋅離子濃度的耐受性情況。如圖2所示，當鋅離子濃度為1200 mg/L時，OD600為0，菌體生長被完全抑制；當鋅離子濃度為50 mg/L時，OD600最大，為0.895。從總體趨勢來看，隨著鋅離子濃度的逐漸增大，OD600的值先升高后降低。這說明，低濃度的鋅離子(50 mg/L)對菌株HXZ-1生長均有刺激作用，而鋅離子濃度高于50 mg/L時會對菌株HXZ-1生長有抑制作用，抑制作用隨濃度增加而增大。這可能是由于高濃度的鋅離子對菌株有一定的毒性，導致新陳代謝活性和生長量降低[6]。據報道，菌株耐鋅濃度為1～10 mmol/L時為中度耐鋅細菌，而耐鋅濃度超過10 mmol/L為抗鋅細菌[18]，菌株HXZ-1能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L，因此可以判斷出菌株HXZ-1為抗鋅細菌。
圖1菌株HXZ-1在LB固體培養基上的菌落形態(A)及其革蘭氏染色(B)的結果
圖2不同鋅離子濃度對菌種HXZ-1生長的影響
2.3 16S rRNA基因擴增
菌株HXZ-1的基因組DNA提取結果見圖3，基因組DNA在電泳圖上的23 130 bp附近一條明顯的條帶，可以用于PCR擴增，16S rRNA序列擴增長度為1500 bp左右。
2.4 16S rRNA基因序列的測定及系統發育分析
根據16S rRNA基因的測序結果，將其序列與EzTaxon-e server(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)數據庫中16S rRNA基因序列進行同源性比較，選擇其中的12株菌的16S rRNA基因序列用于系統發育學分析，采用CLUSTAL_X將菌株XHZ-1的16S rRNA基因序列與其同源關系相近的序列比對分析后[19]，把兩頭的序列剪切整齊，用MEGA version 5.0軟件包中的Kimura-Parameter Distance模型計算進化距離，用Neighbor-Joining構建系統進化樹[20]，1000次隨機抽樣，計算自引導值(Bootstrap)以評估系統進化樹的置信度。結果如圖4，菌株HXZ-1所得16S rRNA基因序列與其序列相近的菌株都在Promicromonospora屬，與模式菌株PromicromonosporaflavaCC 0387T具有最高的相似性為98.46%，結合前述的菌株形態特征，可以鑒定該菌株HXZ-1為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp.HXZ-1)。
圖3菌株HXZ-1的基因組DNA、16S rRNA基因的PCR擴增
圖4菌株HXZ-1的系統發育分析
2.5菌株HXZ-1對不同碳源利用試驗
不同碳源對菌株HXZ-1生長影響的結果如圖5所示。不同的微生物利用糖、醇、有機酸、脂肪酸等的能力有很大的差異，這是菌株鑒定中的一項重要指標。在以NH4NO3作氮源的情況下，供試的8種碳源中：菌株HXZ-1對葡萄糖、甘露醇和蔗糖的利用較好，其中對葡萄糖利用最好，OD600值最大，為0.771；對淀粉、阿拉伯糖和麥芽糖利用較差，說明菌株HXZ-1的最適碳源為葡萄糖。
圖5不同碳源對菌株HXZ-1生長的影響
2.6菌株HXZ-1對不同氮源利用試驗
不同氮源對菌株HXZ-1生長影響的結果如圖6所示。不同的微生物利用氮源的能力有很大的差異，也是菌株鑒定中的一項重要指標。在以葡萄糖作碳源的情況下，供試的7種氮源中：菌株HXZ-1對2種有機氮源蛋白胨、酵母粉利用較好，而對硝酸鈉和亞硝酸鈉的利用較差，當蛋白胨作為氮源時，OD600值最大，為0.728；說明菌株HXZ-1的最適氮源為蛋白胨。
圖6不同氮源對菌株HXZ-1生長的影響
2.7菌株HXZ-1對不同濃度鋅離子的吸附試驗
菌株HXZ-1對不同濃度鋅離子的吸附率如圖7所示。微生物對不同濃度的金屬離子的吸附能力有很大的差異。從總體趨勢來看，隨著鋅離子濃度的增大，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率先升高后降低。在0～50 mg/L，隨著鋅離子濃度的增加，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率呈上升趨勢；當鋅離子濃度大于50 mg/L時，吸附率逐漸減小，當大于200～1000 mg/L之間，吸附率較低。當鋅離子濃度為50 mg/L時，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率最大，為29.1%，這可能與菌株HXZ-1在含有50 mg/L的LB培養基中生長良好有關。
2.8菌株HXZ-1在不同時間內對鋅離子的吸附試驗
微生物在不同生長時間內對金屬離子的吸附能力有很大的差異，在培養體系中鋅離子濃度為500 mg/L時仍能生長的細菌，被認為是耐鋅性較強的微生物[18]。當鋅離子濃度為500 mg/L時，菌株HXZ-1在不同培養時間對鋅吸附率的結果如圖9所示。總的來看，隨著培養時間的延長，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率先升高后降低。該菌株HXZ-1在0～4 h內，吸附率上升趨勢較慢；在4～10 h內，吸附率上升趨勢較快；當培養時間大于10 h時，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率開始下降。試驗表明，當菌株HXZ-1的培養時間為10 h時，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率最大，為18.8%。
圖7培養基中不同鋅濃度時菌體HXZ-1對鋅吸附率的影響
圖8菌株HXZ-1在不同培養時間對Zn2+吸附率的影響
3結論
本研究從某造紙廠的污水中篩選到一株對鋅具有抗性的菌株HXZ-1，對其進行生理生化研究和系統發育分析，將其鑒定為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp.HXZ-1)。當前，抗鋅菌株報道較多，主要在Aspergillus,Penicillium,Sphingomonas,Streptomyces和Verticillium等屬[5-9,21]，尚未在Promicromonospora屬有抗鋅菌株的報道。因此，Promicromonospora屬抗鋅菌株的分離，為鋅污染區域的微生物修復提供了新的菌種資源。
菌株HXZ-1在鋅離子濃度為50 mg/L的LB培養基中生長良好，能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L。菌株HXZ-1在葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源生長最好。當菌株HXZ-1在此最優培養條件下生長，鋅離子濃度為50 mg/L時，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率最大，為29.1%；當鋅離子濃度為500 mg/L時，培養時間為10 h時，菌株HXZ-1對鋅離子的吸附率最大，為18.8%。因此，菌株HXZ-1是一株對鋅有較強抗性和吸附性的細菌，在重金屬鋅污染區域的微生物修復中有著良好的應用潛力。
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