焦化污染場地中萘降解菌株AO-4鑒定、生長、降解機理及環(huán)境條件帶來的影響（三）
2結(jié)果與討論
2.1萘降解菌的篩選及鑒定
通過增加環(huán)境選擇的壓力，逐步提高萘的濃度對菌種進行馴化、篩選，分離到一株萘的高效降解菌株AO-4。菌株在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長良好，驗證了其以萘作為唯一碳源生長的能力，表明其可用于含萘污染物的生物修復(fù)。
AO-4菌株在含萘的MSM固體培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，扁平狀，邊緣不整齊，大小不一，平均直徑約為2.0～3.0mm[圖1(a)]。顯微鏡下可見菌體為桿菌，長約1.5～3.0μm，寬約0.5～0.8μm，革蘭氏染色后呈紅色，為革蘭氏陰性細(xì)菌[圖1(b)]。桿狀細(xì)菌在污染物的微生物降解中非常常見，因為在富集培養(yǎng)過程中，桿菌比球菌能更好地適應(yīng)環(huán)境，可高效利用一些致密顆粒（如PAHs），比球菌分裂更快而成為優(yōu)勢菌群。
圖1菌株AO-4的菌落形態(tài)(a)及革蘭氏染色后細(xì)胞形態(tài)(b)
通過16S rDNA測序及Genbank數(shù)據(jù)庫序列比對，發(fā)現(xiàn)菌株AO-4與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的同源性最高，序列相似度達到99.9%。采用鄰域連接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），顯示菌株AO-4與多株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有高度同源性。已有眾多研究證明，銅綠假單胞菌對多種PAHs具有較強的降解能力，如Patowary等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在35℃和pH=7條件下，對0.3%的萘降解率可達89.2%。
圖2基于菌株AO-4的16S rDNA基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
綜上，依據(jù)菌株AO-4的形態(tài)特征以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株AO-4鑒定為銅綠假單胞菌，此菌株16S rDNA序列已提交到國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（DOI：http://dx.doi.org/10.12210/sequence.NMDCN00011F3）。
2.2萘降解途徑關(guān)鍵酶的基因檢測
假單胞菌對萘的降解通常是通過水楊酸途徑完成的。萘經(jīng)萘雙加氧酶催化開環(huán)形成順-萘雙氫二醇后，在脫氫酶的催化下形成1，2-二羥基萘，再經(jīng)過一系列反應(yīng)生成水楊醛，隨后經(jīng)水楊醛脫氫酶作用形成水楊酸，水楊酸在水楊酸羥化酶催化下形成鄰苯二酚，通過鄰苯二酚2，3-雙加氧酶開環(huán)后被轉(zhuǎn)化為乙醛和丙酮酸進入三羧酸循環(huán)，最終被降解為H2O和CO2。
選取了萘經(jīng)水楊酸代謝途徑降解的關(guān)鍵酶基因：萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基（nahAC）、水楊醛脫氫酶（nahF）、水楊酸羥化酶（nahG）和鄰苯二酚2，3-雙加氧酶（nahH）分析菌株對萘可能的降解途徑。以菌株AO-4染色體為模板進行上述四種基因的特異性擴增，凝膠電泳圖（圖3）上可見nahAC和nahH在750～1000bp位置均出現(xiàn)明顯條帶，與文獻中假單胞菌的nahAC（1009bp）、nahH（923bp）基因大小基本一致，可基本判斷AO-4的基因組中含有nahAC、nahH兩個基因。在AO-4的基因組中未檢測到基因nahF和nahG，一方面這可能是由于該菌株對污染物萘的降解有別于已知的降解途徑；另一方面有研究表明，PAHs的部分降解基因位于菌株的質(zhì)粒上，此處未對菌株的質(zhì)粒DNA進行擴增，這可能是nahF和nahG這兩個基因未被檢出的原因。
圖3萘降解途徑中的部分關(guān)鍵酶基因nahG、nahF、nahAC和nahH的PCR擴增結(jié)果
先前研究表明所有的萘降解菌都含有nahAC基因，通過對萘降解途徑中的關(guān)鍵酶基因（nahAC、nahH、nahF和nahG等）進行檢測，可以初步篩選萘降解菌株、判斷菌株的萘降解途徑，但對降解途徑的進一步探究還需對中間產(chǎn)物進行檢測。
2.3菌株AO-4對萘的降解性能
研究考察了菌株AO-4在液體中對萘的降解能力，萘濃度為菌株馴化的最高濃度400mg/L，體系的pH為7.0，接種菌量為2%（體積分?jǐn)?shù)）。在降解過程中監(jiān)測了菌株AO-4的生長曲線、萘的降解率和菌體脫氫酶活性隨時間的變化，結(jié)果如圖4所示。
圖4菌株AO-4對萘的降解特性
從菌株生長曲線[圖4(a)]可以發(fā)現(xiàn)，菌體濃度隨時間變化逐漸增大，在24h OD600達到0.325后增長速度減緩，菌株生長經(jīng)歷了適應(yīng)期、對數(shù)期后將進入穩(wěn)定期。菌株AO-4在以萘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)液的生長再次驗證了菌株AO-4代謝萘的能力。
菌株AO-4對萘的降解率[圖4(b)]在反應(yīng)開始的8h內(nèi)略有增長，在8～24h之間400mg/L的萘近乎被完全降解，24h時萘的降解率達到97.67%，48h降解完全。這與菌株生長曲線變化趨勢相近，8～24h期間，菌株迅速生長，降解率快速攀升；24h后菌株處于穩(wěn)定期，代謝過程緩慢。在研究玫瑰色紅球菌對芘降解特性時，也有類似現(xiàn)象，菌株在8d降解率達到47%后，8～16d時菌株處于穩(wěn)定期或衰亡期，降解率無明顯變化。
脫氫酶活性[圖4(c)]在前8h升高比較緩慢，8～24h迅速升高，在24h后仍有緩慢增長的趨勢。PAHs的降解是基于PAHs的氧化，降解過程中脫氫酶可以使PAHs的氫原子活化并轉(zhuǎn)移至特定的受氫體，使PAHs被氧化。脫氫酶活性可在一定程度上反應(yīng)微生物對有機污染物的氧化降解能力。以上結(jié)果表明菌株AO-4可有效利用400mg/L萘作為碳源生長，菌體的脫氫酶活性，菌株生長情況與萘的降解率表現(xiàn)出正相關(guān)。
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