發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒構(gòu)建燈盞花發(fā)根最優(yōu)的培養(yǎng)體系（二）
1.2.3葉盤法轉(zhuǎn)化
將燈盞花無菌苗葉片剪成約0.5 cm2大小的葉盤，分別置于B5、1/2B5、1/2MS、MS固體空白培養(yǎng)基上25℃恒溫暗培養(yǎng)2 d(預(yù)培養(yǎng))。將部分葉盤不作農(nóng)桿菌浸染處理，以作對照。其余預(yù)培養(yǎng)后的葉盤分別放入制備好的OD600為0.4、0.6、0.8的3種濃度的農(nóng)桿菌菌液中，分別浸染5、10、15 min，撈出后吸干殘留菌液。再分別放回預(yù)培養(yǎng)時的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養(yǎng)基，25℃，分別無光恒溫共培養(yǎng)0、1、2、3 d。之后將共培養(yǎng)的葉盤對應(yīng)轉(zhuǎn)到含500 mg/L頭孢噻污鈉(Cef)的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養(yǎng)基，25℃無光恒溫除菌培養(yǎng)10～15 d后，一般可看到葉盤邊緣傷口處有發(fā)根長出，待發(fā)根長至2～3 cm后將其剪下，分別對應(yīng)在新的含500 mg/L Cef及10 mg/L潮霉素B(Hyb)的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌篩選培養(yǎng)，每15～20 d更換1次培養(yǎng)基。每更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)基其他成分不變，抗生素Cef濃度按500 mg/L→300 mg/L→100 mg/L→0 mg/L階梯性降低，直至除菌完全。
最后統(tǒng)計比較不同菌液濃度(處理A—OD600=0.4；B—處理OD600=0.6；C—處理OD600=0.8)、不同浸染時間(處理a—5 min；處理b—10 min；處理c—15 min)和不同共培養(yǎng)時間(處理1—0 d；處理2—1 d；處理3—2 d；處理4—3 d)對葉盤發(fā)根誘導(dǎo)率、葉盤死亡率及染菌率等的影響，從而得出燈盞花發(fā)根最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。
1.2.4發(fā)根鑒定
取在除菌篩選培養(yǎng)基上仍生長良好的發(fā)根約100 mg，采用CTAB法提取總DNA，以總DNA為樣品模板，同時以C58C1菌為陽性對照，以非轉(zhuǎn)化根DNA為陰性對照，PCR鑒定毛狀根總DNA中是否含發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 Ri質(zhì)粒的rolB和rolC基因：1)primers forrolB:rolB-F:5′-CGA GGG GAT CCG ATT TGC TT-3′；rolB-R:5′-GAC GCC CTC CTC GCC TTC CT-3′。2)primers forrolC:rolC-F:5′-TCG CCA TGC CTC ACC AAC TCA C-3′；rolC-R:5′-CCT TGA TCG AGC CGG GTG AGA A-3′。3)反應(yīng)體系(20μL)：ddH2O 7μL,Template DNA 1μL,Forward Primer(10μmol/L)1μL，Reverse Primer(10μmol/L)1μL,2×rTaq PCR SuperMix 10μL。4)PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，35個循環(huán)；72℃5 min。凝膠成像系統(tǒng)下觀察DNA條帶。
1.2.5液體振蕩擴大培養(yǎng)
選取除菌完全且鑒定為陽性的發(fā)根，剪取約300 mg，分別放入裝有200 mL B5、1/2B5、1/2MS、MS液體培養(yǎng)基的三角瓶，置于搖床上，25℃避光，100 r/min振蕩培養(yǎng)，每周更換1次培養(yǎng)基并稱質(zhì)量，比較不同培養(yǎng)基對發(fā)根生長速率的影響。
2結(jié)果與分析
結(jié)果顯示，對照組未經(jīng)農(nóng)桿菌浸染誘導(dǎo)處理的葉盤也有極少部分長出了不定根。燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)流程見圖1。經(jīng)農(nóng)桿菌浸染處理的試驗組葉盤，因培養(yǎng)條件不同，表現(xiàn)出了不同的誘導(dǎo)率。具體誘導(dǎo)率見表1。
A.葉盤預(yù)培養(yǎng);B.誘導(dǎo);C.除菌篩選培養(yǎng);D.液培
圖1燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)流程
注：為方便統(tǒng)計，表中所述長出發(fā)根的葉盤數(shù)是指凡是葉盤邊緣長出了根的葉盤的數(shù)量，這些根不一定是發(fā)根，因此，誘導(dǎo)率也并不一定是陽性誘導(dǎo)率；死亡和染菌嚴(yán)重的葉盤數(shù)指培養(yǎng)過程中黃化死亡未能長出發(fā)根的，及雖長出了發(fā)根但染菌嚴(yán)重，無法脫菌完全的葉盤總數(shù)。
2.1發(fā)根的鑒定
按上述發(fā)根鑒定方法對脫菌完全的發(fā)根提取DNA進(jìn)行PCR鑒定，其中對照組絕大部分在除菌篩選培養(yǎng)時已黃化死亡，少數(shù)存活的不定根PCR鑒定也均不含rolB、rolC基因，因此不是發(fā)根。試驗組則大部分是有rolB、rolC基因的陽性發(fā)根。PCR鑒定結(jié)果如圖2。陽性發(fā)根則于液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。
M:T-2000 DNA Maker;N:陰性對照;P:陽性對照;1～10:樣品
圖2發(fā)根中rolB、rolC基因PCR鑒定結(jié)果
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