廣西牛肺炎支原體病原的分離和鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)分析（上）
近幾年來(lái)廣西從外省引進(jìn)肉牛飼養(yǎng)的現(xiàn)象很普遍，因運(yùn)輸應(yīng)激因素誘發(fā)呼吸系統(tǒng)癥狀的疾病經(jīng)常發(fā)生，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、流涕、咳嗽和呼吸困難，最終導(dǎo)致死亡。給養(yǎng)殖戶(hù)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。為了弄清病因，2013年8月我們對(duì)桂林市某牛場(chǎng)出現(xiàn)的類(lèi)似病例進(jìn)行了病原調(diào)查。該場(chǎng)原有存欄牛336頭，2013年7月11日從北方某省引進(jìn)肉犢牛93頭，到場(chǎng)后隔離觀察，第3天發(fā)現(xiàn)有牛出現(xiàn)喘氣，體溫升高。隨后多數(shù)牛也開(kāi)始發(fā)病并出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難，臥地不起，拉稀或血樣糞便，部分牛最后因衰竭而死。曾用頭孢類(lèi)抗生素治療無(wú)效，整個(gè)病程27頭牛發(fā)病，死亡7頭，發(fā)病率和病死率分別為29%（27/93）和25.9%（7/27）。剖檢病死牛，病變局限在胸腔與肺部，肺尖葉、心葉和膈葉都表現(xiàn)出不同程度的紅色肉變，肺間質(zhì)增寬，還可見(jiàn)大小不等的黃白色壞死灶，氣管、支氣管里有大量的乳白色泡沫。胸腔有少量積液，心包積水，液體呈清亮黃色。其他臟器未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)病理變化。經(jīng)對(duì)病原分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和病原特異性基因PCR檢測(cè)，鑒定該病病原為牛支原體。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
病死牛肝、腎、肺、淋巴結(jié)。
1.2試劑和儀器
PPLO肉湯粉，購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司；瓊脂、TSA瓊脂、酵母，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；馬血清，購(gòu)自廣東蕊特生物科技有限公司；青霉素，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)oCelloScope，購(gòu)自丹麥Biosense；微量DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker2、PCR Taq Mix，購(gòu)自廣東東盛生物科技有限公司；PCR儀，購(gòu)自日本TaKaRa公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Alpha Inotech公司。
1.3方法
1.3.1病原分離、形態(tài)觀察、細(xì)菌L型實(shí)驗(yàn)和生化性狀測(cè)定等均按石磊的方法進(jìn)行。
1.3.2病原PCR鑒定
按李大偉的方法進(jìn)行病原的牛支原體特異性基因opp D/F的PCR鑒定，同時(shí)應(yīng)用牛傳染性胸膜肺炎特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行鑒別診斷。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體中，對(duì)獲得的克隆進(jìn)行鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序和分析。
1.3.3藥敏試驗(yàn)
oCelloScope可量化添加抗菌藥物后牛肺炎支原體的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，快速確定支原體的生長(zhǎng)情況和對(duì)抗生素的耐藥性。
1.3.4其他細(xì)菌的分離
無(wú)菌取病牛肝、腎、肺、淋巴結(jié)分別接種TSA瓊脂培養(yǎng)基和兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。
2結(jié)果
2.1病原的分離培養(yǎng)和菌落形態(tài)
初次培養(yǎng)時(shí)，將肺組織勻漿后的上清液接種PPLO培養(yǎng)液后3 d，培養(yǎng)基顏色開(kāi)始變?yōu)樽攸S色，繼續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基顏色變色時(shí)間縮短，在1——2 d，便可由紅色變?yōu)樽攸S，培養(yǎng)液顏色均一，透亮無(wú)混濁現(xiàn)象。固體培養(yǎng)基上，2——4 d便可見(jiàn)針尖大小的菌落生長(zhǎng)，在4X10倍視野下觀察所有平皿均有典型的“煎蛋樣”菌落出現(xiàn)，核心較厚，向下長(zhǎng)入培養(yǎng)基中，周邊為一薄層的透明區(qū)（圖1）。
圖1病原菌落觀察（4X10）
圖2病原姬姆薩染色觀察（10X100）
2.2病原的染色形態(tài)觀察結(jié)果
分離的病原革蘭染色不易著色，難以觀察；姬姆薩染色呈紫藍(lán)色，菌體呈現(xiàn)明顯的多形態(tài)，多數(shù)呈球形，也有少數(shù)長(zhǎng)短不一的桿狀或蝌蚪狀的菌體散在分布（圖2）。
廣西牛肺炎支原體病原的分離和鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)分析（上）
廣西牛肺炎支原體病原的分離和鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)分析（下）
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