微藻篩選純化方法優(yōu)缺點對比、分類和鑒定（二）
2.2.2 DNA多態(tài)性分析技術
DNA多態(tài)性分析技術是以基因序列為基礎，根據(jù)基因序列間差異進行比較、分析確定其分類，該技術最為直接有效。而不同微藻之間的差異是因其基因組DNA堿基序列間不同引起的，因此，只要測出微藻基因組序列，比較其差異，就可以進行分類，其結果可靠、準確性高。但是，微藻的基因組DNA較為龐大復雜，且種類繁多，全部測序耗財、耗力、耗時。而目前所采用的主要手段是從基因組中選擇有代表性的某些片段作為分類標準，通過分析片段間的差異，以確定物種間的遺傳差異，達到準確分類。
目前在基因水平的分類研究中，主要以線粒體基因組（mitochondrial DNA）、葉綠體基因組（chloroplast DNA）和核基因組（nDNA）的基因序列及其內(nèi)部轉錄間隔區(qū)Ⅰ和Ⅱ作為分類依據(jù)。例如，許多國外研究者利用mtDNA中的細胞色素c氧化酶基因做藻類分類，通過對細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行系統(tǒng)進化分析，分類效果較好;但是mtDNA重排率高、突變率低，進化速度慢，鑒別位點有限，在同源性分析上受到一定影響，同時在微藻基因組中的拷貝數(shù)低，提取純化困難，所以在微藻分類中應用有限，一般運用于較高等級的分類，如屬間、科間甚至更高。而在藻類cpDNA中，由于序列差異比較大，多數(shù)在120～220kb之間，所以研究起來較為方便。實驗表明，任何2種植物之間其cp DNA至少有30%的同源性，同源性越高，它們在分類群中親緣關系就越近。而目前對微藻進行屬及以上水平進行分類時，cp DNA中的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基（rbcL）基因使用者較多，且分類結果可靠。核糖體基因功能同源且古老，既含有保守區(qū)又含有可變區(qū)，且具有高度重復序列，如：編碼核糖體RNA（rDNA）的基因和轉錄間隔區(qū)（ITS），因此可作為微藻分類依據(jù)。而在核糖體基因分類研究中18srDNA和ITS使用者較多，因其分子大小適合操作，效果顯著，被廣泛應用于微藻分類學研究。但是，ITS序列在微藻種內(nèi)高度保守，而在種間差異較大，適宜于不同種間的分類，不適宜于科及以上水平的分類。
2.3光譜微藻
色素豐富，種類多樣，色素成分和濃度差異導致其光譜信息，如吸收光譜，熒光光譜和拉曼光譜存在一定差異，根據(jù)差異可以反推或間接確定微藻的種類，因此結合化學計量學方法，利用紅外光譜能夠進行微藻的快速鑒定、判別和分類。如Lin等人利用高光譜顯微成像系統(tǒng)鑒定形態(tài)相似的銅綠微囊藻，然后使用Fisher算法來識別微藻物種，其敏感性和特異性很高，結果證明了這種方法可以快速方便地對微藻進行分類，并且還可以獲取樣本的數(shù)量和空間信息。朱慧云等使用已建立的光譜采集系統(tǒng)可有效地識別4種微藻種，為微藻種的鑒定和分類提供了新的途徑。使用Vis/NIR光譜儀和便攜式光學探針的方法適用于各種微藻物種，是一種快速、精確、無損的檢測方法。
2.4變性梯度凝膠電泳技術
變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）是一種重要的分子多態(tài)性技術，在物種鑒定及浮游生物群落多樣性研究方面有著廣泛的應用，而將DGGE技術運用到微藻鑒定中也有許多研究，通常選擇18S rDNA和28S rDNA的片段或其它區(qū)間作為特征區(qū)域，通過DGGE電泳，從而獲得微藻的特征性條帶進行微藻分類。通過DGGE技術對藻類的特征區(qū)域進行差異性分析，可以達到較好的區(qū)分效果，同時根據(jù)其條帶強弱還能觀測出樣品中的優(yōu)勢微類。但是，該技術所需設備昂貴，對實驗室條件有一定的要求，且操作繁瑣，耗時耗力，不適于批量操作。
3、展望
隨著微藻生物應用和微藻功能研究的不斷深入，正確篩選鑒定和分類是基礎，也是一項嚴峻的挑戰(zhàn)。對微藻進行篩選時，平板劃線法雖然操作繁瑣耗時長卻是最可靠穩(wěn)妥的方法，操作也較為簡單，目前微藻篩選方面需亟待解決的仍然是篩選方法及周期問題。
對微藻分類時，特別是依據(jù)形態(tài)學特征進行表征時，僅通過普通光學顯微鏡難以觀測其表型結構，而電子顯微鏡價格昂貴，此外，一些微藻形態(tài)、大小和表型結構在不同生長期會發(fā)生變化或未表露出來，以至于無法做出準確的判斷。目前，對微藻分類多采用傳統(tǒng)分類結合分子技術手段進行，在分子生物學中，線粒體基因組（mitochondrial DNA;mtDNA）、葉綠體基因組（chloroplast DNA;cpDNA）和核基因組（nDNA）的基因序列及其轉錄間隔區(qū)3者的方法使用較多，是快速鑒定方法。但是，僅依靠1種判斷依據(jù)對近緣種屬間微藻進行分類時，結果會有一定誤差，因此需要選用多個判斷標準，多重比較才能得出較準確的結論。選擇ITS1-2和葉綠體中rbcL以及18sRDNA特征區(qū)域作為判斷依據(jù)是最經(jīng)濟有效可行的手段，目前最為廣泛使用。此外，微藻分類研究中，基因組DNA提取不易，試劑盒昂貴，應尋找更為方便快捷的提取基因組方法，或直接利用PCR方法擴增特征區(qū)域，使實驗更高效。
對微藻鑒定時，通常先將序列比對，然后構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析確定其在遺傳系統(tǒng)中的地位。此外，今后藻類分類學研究不能僅僅局限于尋求新的分子指標，也需要借助當前先進儀器，創(chuàng)新思維并尋求更合適的分類方法，還應該去發(fā)現(xiàn)某些藻類特有組分，為藻類分類學研究提供準確依據(jù)。
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