中藥單體組合物綠原酸、黃芩苷、厚樸酚對大腸桿菌生長曲線的影響
摘要：旨在研究由不同單體組成的中藥單體組合物對多重耐藥大腸桿菌的抑菌作用。通過最小抑菌濃度（MIC）、分級抑菌指數（FICI）、中藥單體組合物的篩選、中藥單體組合物的劑量配比優化等試驗，獲得一種由綠原酸、黃芩苷、厚樸酚按照質量比為2∶4∶1的中藥單體組合物。通過測定中藥單體組合物對多重耐藥大腸桿菌的生長曲線、相對電導率、核酸和蛋白滲漏、胞外堿性磷酸酶（AKP）含量、胞內DNA含量變化的影響，初步探究中藥單體組合物對多重耐藥大腸桿菌的體外抑菌作用。結果顯示：綠原酸、黃芩苷、厚樸酚、硫酸小檗堿對多重耐藥大腸桿菌的MIC分別為6.25、6.25、6.25和1.25 mg/mL,不同組分之間存在協同或相加作用，其中綠原酸和厚樸酚聯用的FICI為0.5.中藥單體組合物可以抑制細菌的生長，破壞大腸桿菌細胞的完整性，引起細胞內容物滲漏使菌液的電導率顯著升高（P<0.05），菌液OD260 nm、OD280 nm值顯著升高（P<0.05），AKP含量顯著升高（P<0.05），DNA含量變化明顯。本研究表明中藥單體組合物主要通過破壞多重耐藥大腸桿菌的細胞膜、細胞壁的結構完整性從而實現抑菌作用，為中藥復方治療或預防細菌性疾病的藥物篩選和研發奠定基礎。
大腸桿菌病是威脅畜禽養殖的頭號細菌病，是由大腸桿菌感染引起的一種多發的傳染性疾病。隨著我國養殖業集約化程度不斷提高，畜禽大腸桿菌病在各地的流行趨于嚴重。畜禽患病后引起急性敗血癥或多組織器官炎癥從而影響畜禽繁殖機能，甚至可能導致畜禽死亡，對畜禽養殖戶造成極大的經濟損失。目前對禽大腸桿菌病主要是采用抗生素治療，但是隨著耐藥菌株的不斷出現，耐藥譜的不斷增加，給禽大腸桿菌病的防治帶來了重重困難。在國家“減抗”、“替抗”政策的推動下，在大腸桿菌疫苗效果不理想、耐藥菌株不斷出現的情況下，中草藥因其來源廣泛、藥理作用多樣且不易產生耐藥性等優點吸引了研究者的廣泛關注，其在畜禽養殖業具有廣闊的應用前景。中草藥及其提取物對細菌、真菌都有較好的抗菌效果。然而單味中藥效果單一，而復方中藥因存在多個有效部位，具有多層次的復合效果，因此開發替代抗生素的低毒或無毒副作用、安全高效的抗微生物復方中藥是當今研究的熱點。根據中獸醫辨證論治原則，雞大腸桿菌病可辨為濕熱證，應選擇清熱燥濕，涼血止痢的中藥。黃芩、黃連性味苦、寒，有清熱燥濕、瀉火解毒之功效；金銀花性味甘、寒，有清熱解毒、疏散風熱之功效；厚樸性味苦、辛、溫，有行氣燥濕，逆降平喘之功效。諸藥合用，共奏清熱解毒、化濕和中理氣之功效。黃芩苷、小檗堿、厚樸酚、綠原酸分別為我國傳統中藥黃芩、黃連、厚樸、金銀花中的主要有效活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多重功效。
本試驗結合實驗室前期研究基礎，通過體外篩選敏感中藥單體以及結合正交試驗優化出中藥單體組合物最優配比。探討中藥單體組合物對禽致病性大腸桿菌的抑菌作用，為今后禽大腸桿菌病的防控提供理論依據，為解決禽致病性大腸桿菌日趨嚴重的耐藥性問題提供一種新的治療策略，為治療或預防細菌性疾病的中藥復方藥物篩選和研發奠定基礎。
細菌生長曲線的測定
將細菌劃線接種在LB固體培養基上，37℃恒溫培養箱過夜培養。挑取固體培養基上長勢良好的單一菌落接種于LB營養肉湯中，于37℃、220r/min的條件下恒溫搖床培養過夜孵育。將過夜培養的細菌懸液按照1∶100的比例接種于無菌的LB營養肉湯（稀釋至106CFU/mL），然后在菌懸液中分別加入不同藥物配制相應的濃度，每種組合設置3個重復。相同體積的單獨加入藥物無菌LB營養肉湯作為對照，混合液放入恒溫振蕩器（37℃、220r/min）中培養。通過檢測評價不同藥物對大腸桿菌的生長情況，0——18h,每隔1h測定菌液在600nm波長處的吸光值，單獨加入藥物的營養肉湯用于空白調零。試驗進行3次重復。
中藥單體組合物綠原酸——黃芩苷——厚樸酚對大腸桿菌生長曲線的影響
如圖1可知，未經處理的多重耐藥大腸桿菌的生長曲線呈典型的“S”型，大約在培養6——8h左右到達對數生長期，細菌在14h之后數量趨于平穩。與空白組相比，在培養的初始階段添加不同濃度的中藥單體組合物后，細菌的生長受到抑制。在同一培養時間下，3種濃度中藥單體組合物處理后的菌液的OD值均低于空白對照組，且菌體進入對數生長期的時間滯后，當添加1/2MIC、1MIC的中藥單體組合物后，細菌的生長被抑制，平穩期的數量降低。而2MIC濃度中藥單體組合物與細菌作用后，細菌的生長被完全抑制，培養周期內OD值基本沒有變化，說明本研究篩選到的中藥單體組合物對大腸桿菌生長情況有抑制作用。
圖1中藥單體組合物綠原酸——黃芩苷——厚樸酚對大腸桿菌E——32生長曲線的影響
中藥可從通過影響細菌生長、干擾細胞壁合成、損傷胞漿膜、影響細胞蛋白合成、影響核酸合成等多方面表現抗菌作用。通過測定黃連配方顆粒、標準湯劑及鹽酸小檗堿對大腸桿菌生長曲線等試驗的影響，研究了其對大腸桿菌的抑菌機理。本試驗篩選出最優中藥單體組合物綠原酸——黃芩苷——厚樸酚并探究了其對多重耐藥大腸桿菌生長情況的影響，發現中藥單體組合物對細菌的抑制作用與時間和濃度有關，1/2MIC和1MIC處理組的抑菌效果隨著時間的延長逐漸減弱，而2MIC組在0——18h的抑菌曲線保持不變，說明濃度為2MIC時可以完全抑制大腸桿菌的生長。這些結果表明，綠原酸、黃芩苷和厚樸酚組成的中藥單體組合物具有很好的抗菌能力。