?嗜黏蛋白阿克曼菌在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中的生長情況與代謝產(chǎn)物（一）
嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）被稱作新一代益生菌，是一種典型的哺乳動物腸道菌，依賴于腸道上皮細胞分泌的黏蛋白生存，是腸道黏液層的關鍵微生物，更與多種疾病存在重要關聯(lián)。Akk作為一種典型的腸道菌，只能耐受低濃度的氧氣，其體外培養(yǎng)更是生長周期長、生長速度慢。本團隊研究發(fā)現(xiàn)，Akk可利用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基成分簡單價格便宜，唯其生長速度較為緩慢。
東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,乳品科學教育部重點實驗室的武曉玲、徐珒昭、許曉曦*等人利用非靶向代謝組學技術對比分析Akk在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的差異，結(jié)合京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路探究其特征性代謝產(chǎn)物與疾病的關聯(lián)，并以此證明優(yōu)化培養(yǎng)基在工業(yè)化高密度培養(yǎng)中的優(yōu)勢及應用前景，旨在為Akk在中國的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學基礎。
1 Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長情況對比
由于Akk在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中生長其菌液密度極低（生長速度慢且活菌數(shù)較少），因此本課題組前期在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基的基礎上，對Akk培養(yǎng)基進行優(yōu)化。為確定Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長穩(wěn)定期以制備發(fā)酵上清液樣本，并對比Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長情況，通過測定菌液OD600 nm并繪制生長曲線，結(jié)果如圖1所示。
由圖1可知，0～8 h為Akk的生長遲緩期，12 h左右進入生長對數(shù)期。在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，Akk生長對數(shù)期為12～32 h，32 h菌液OD600 nm達到最高（0.269±0.003），之后進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期活菌數(shù)為6.75×107 CFU/mL。而在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長對數(shù)期同樣在12 h左右進入對數(shù)期，44 h時菌液OD600 nm最高可達0.761±0.011，是硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基的2.83倍，并在44 h之后趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定期的活菌數(shù)為1.74×109 CFU/mL，比硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基高出2個數(shù)量級。由此可知，優(yōu)化后的培養(yǎng)基雖相對延長了Akk的對數(shù)生長期，但顯著提高了Akk的菌液密度及活菌數(shù)。并由此選擇其在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中進入生長旺盛期的32 h和44 h發(fā)酵上清液，用以分析兩組樣本的差異代謝物。
2差異性代謝組學分析結(jié)果
2.1 QC分析
為評價儀器的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性，分別在正負離子模式下將QC樣本總離子流圖進行譜圖重疊比較，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明兩種模式下各色譜峰的響應強度和保留時間均基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小，實驗結(jié)果較為可靠。
2.2代謝物鑒定數(shù)量及化學分類歸屬統(tǒng)計
通過高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測Akk在兩種培養(yǎng)基發(fā)酵上清液中的代謝產(chǎn)物，正負離子模式下合計鑒定到代謝產(chǎn)物2 253種，其中正離子模式下鑒定到代謝產(chǎn)物1 585種，負離子模式下鑒定到668種。根據(jù)化學分類歸屬信息將所有代謝物進行分類統(tǒng)計，各類代謝物數(shù)量所占比例如圖3所示。
兩組樣本中檢測到的代謝物包括有機酸及其衍生物（34.976%），脂質(zhì)和脂質(zhì)類分子（21.127%），有機雜環(huán)化合物（10.567%），苯甲酸類（6.569%），有機氧化合物（5.237%），苯丙烷和聚酮（4.172%），核苷、核苷酸和類似物（2.308%），有機氮化合物（1.243%），生物堿及其衍生物（0.666%），木質(zhì)素、新木質(zhì)素及相關化合物（0.178%），有機金屬化合物（0.133%），有機硫化合物（0.133%），烴類衍生物（0.089%）和未命名化合物（12.605%）等。
2.3組間差異分析
本研究結(jié)合單變量統(tǒng)計分析和多維統(tǒng)計分析方法，篩選Akk在兩種培養(yǎng)基中的顯著性差異代謝物，對正、負離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物進行分析。
單變量統(tǒng)計分析
在進行兩組樣本間的差異分析時，常用的單變量統(tǒng)計分析方法包括差異倍數(shù)（FC）分析、T檢驗/非參檢驗。基于單變量分析，對正、負離子模式下檢測到的所有代謝物（含未被鑒定的代謝物）進行差異分析，篩選出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差異代謝物共902種，其中正離子模式下670種，負離子模式下232種。將這些差異代謝物用火山圖的形式表示，結(jié)果如圖4所示。
如圖4所示，每個圓圈代表一個特定的代謝產(chǎn)物，優(yōu)化后相對優(yōu)化前，紅色為顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物（FC＞1.5，P＜0.05），藍色為顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物（FC＜0.67，P＜0.05），圓圈越靠近左右兩邊和上邊，差異性越顯著，黑色為非顯著性差異代謝物。之后研究均針對紅色和藍色圓圈代表的顯著性差異代謝物。
多維統(tǒng)計分析
多維統(tǒng)計分析可以從總體水平反映組間差異以及組內(nèi)的變異度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。將鑒定到的所有代謝物重新線性組合得到PCA模型，采用PCA方法，能從總體上反映樣本的總體分布趨勢和組件樣本的差異度。兩組樣本的PCA得分圖如圖5所示。
圖5中橢圓代表95%置信區(qū)間，同一顏色的點表示組內(nèi)的各個生物學重復，由點的分布狀態(tài)可以看出，該模型可以區(qū)分兩組樣本，組間樣本的數(shù)據(jù)點很好地集中在一起。PCA模型參數(shù)R2X越接近1表明模型越可靠，正、負離子模式下的模型解釋率R2X分別為0.835和0.855。結(jié)果表明該模型穩(wěn)定可靠，實驗重復性好，隨機誤差較小，可進一步對樣本進行差異性分析。
OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗如圖6所示，t能最大程度反映組間差異，而to則反映組內(nèi)變異?？梢钥闯鯫PLS-DA模型可顯著區(qū)分兩組樣本，且組內(nèi)差異較小，結(jié)果與PCA模型一致。經(jīng)7次循環(huán)交互驗證得到模型評價參數(shù)R2Y、Q2，通常情況下Q2＞0.5即表明模型穩(wěn)定可靠。該模型正、負離子模式下的Q2分別為0.998、0.999，均大于0.5。在置換檢驗中，隨著置換保留度逐漸下降，隨機模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)定性良好。
篩選差異代謝物
OPLS-DA模型得到的變量權重值（VIP）表示變量投影重要度，值越大，表示越重要。本實驗以VIP＞1和P＜0.05為顯著性差異代謝物的篩選標準，正離子模式下篩選到670種顯著性差異代謝物，負離子模式下篩選到232種顯著性差異代謝物，由于篩選到的差異代謝物過多，且表格無法直觀地顯示這些代謝物的FC，因此，選擇VIP值前50的差異代謝物，以柱狀圖形式展示鑒定到的顯著性差異代謝物的FC變化，結(jié)果如圖7所示。可以看出，與硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基相比，Akk在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵后，正離子模式下22種代謝產(chǎn)物顯著上調(diào)，28種代謝產(chǎn)物顯著下調(diào)，負離子模式下顯著上調(diào)代謝產(chǎn)物22種，顯著下調(diào)代謝產(chǎn)物28種。后續(xù)將對這些顯著性差異代謝產(chǎn)物進行分析。
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