微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)檢測抗生素體外動態(tài)抗菌作用的潛力
在革蘭氏陰性菌出現(xiàn)耐藥性的時代，越來越需要體外數(shù)據(jù)來支持抗生素治療的臨床證據(jù)不足。時間殺滅實驗和中空纖維感染模型通常用于預(yù)測細(xì)菌殺滅和耐藥性發(fā)展的最佳抗生素方案。盡管體外研究結(jié)果的臨床相關(guān)性尚未完全確定，但這些結(jié)果對于指導(dǎo)選擇要在體內(nèi)進(jìn)一步評估的物質(zhì)和劑量方案很有價值。然而這些方法是相當(dāng)勞動密集型的并且對于大量抗生素的評價是不可行的。能夠?qū)Χ喾N抗生素方案進(jìn)行高通量篩選的其他方法在尋找有效對抗多重耐藥菌株的療法方面將是有價值的。已經(jīng)開發(fā)了許多用于快速評估抗生素活性的自動化方法。這些方法中的大多數(shù)提供了關(guān)于實驗過程中細(xì)菌殺死和生長動態(tài)的有限信息。Bioscreen C基于濁度測量已用于研究以連續(xù)監(jiān)測細(xì)菌生長。然而這種方法需要高細(xì)菌接種量來檢測光密度(OD)的變化以及與每毫升菌落形成單位(CFU)的相關(guān)性，如活菌計數(shù)確定的那樣是不確定的。本研究旨在評估oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)檢測抗生素體外動態(tài)抗菌作用的潛力。將兩種大腸桿菌和一種銅綠假單胞菌菌株暴露于環(huán)丙沙星、粘菌素、厄他培南或美羅培南，代表具有不同作用機制的三種抗生素類別。將使用oCelloScope獲得的數(shù)據(jù)與Bioscreen C的結(jié)果進(jìn)行比較，并且之前使用相同的設(shè)置和在選定時間點通過活菌計數(shù)獲得的細(xì)菌濃度進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)時間殺滅實驗。
丹麥Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
細(xì)菌生長曲線是通過延時成像和oCelloScope系統(tǒng)的BCA算法分析生成的。首先將抗生素原液裝入清除平底96孔微孔板，在37°C下預(yù)熱約15分鐘，然后用起始培養(yǎng)物接種以達(dá)到每孔總體積為250μL。在將微孔板放入oCelloScope之前，用高度透明的qPCR膜覆蓋微孔板。為了盡量減少溫度波動，oCelloScope儀器被放置在Thermo Scientific Heratherm培養(yǎng)箱中，設(shè)置為37°C。使用底部搜索選項確定每個孔的最佳焦點。對于每個孔，每15分鐘拍攝五張圖像，持續(xù)24小時，圖像之間的距離為4.9μm，掃描長度為180μm。所有實驗一式三份進(jìn)行。來自oCelloScope實驗的圖像使用生長動力學(xué)分析算法進(jìn)行分析：BCA（以前稱為像素直方圖求和或PHS）和SESA算法。BCA算法通過首先校正背景強度以產(chǎn)生具有均勻光分布的圖像來檢測細(xì)菌生長，然后計算閾值像素值以將圖像像素分為背景像素和對象像素。然后根據(jù)對象像素數(shù)量的變化計算細(xì)菌生長曲線。
結(jié)論
近些年已經(jīng)開發(fā)了許多用于快速評估抗生素活性的自動化方法。這些方法中的大多數(shù)提供了關(guān)于實驗過程中細(xì)菌殺死和生長動態(tài)的有限信息。例如Bioscreen C是基于濁度測量，已用于研究以連續(xù)監(jiān)測細(xì)菌生長。然而這種方法需要高細(xì)菌接種量來檢測光密度(OD)的變化以及與每毫升菌落形成單位(CFU)的相關(guān)性，如活菌計數(shù)確定的那樣，測試得到的數(shù)值是不確定的。最近開發(fā)的一個系統(tǒng)，oCelloScope基于數(shù)字延時顯微鏡和圖像分析，也被提議用于測量實時細(xì)菌生長。使用這種方法，每個時間點的圖像都使用選定的算法同時處理例如，背景校正吸收（BCA）和表面積的分割和提取（SESA）。oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)用于研究暴露于-內(nèi)酰胺抗生素和環(huán)丙沙星時大腸桿菌的細(xì)菌形態(tài)，以及暴露于丙酸時青霉菌的細(xì)菌形態(tài)。oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)具有有效評估抗菌活性的潛力，可用于抗生素的高通量篩選，單獨或與其他藥物聯(lián)合使用。研究發(fā)現(xiàn)與Bioscreen C相比，oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)提供了關(guān)于105至107 CFU/mL范圍內(nèi)的細(xì)菌生長動態(tài)和形態(tài)特征的額外信息。總之oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)非常適合于抗生素體外效果的檢測，特別是在需要檢測大量方案的情況下。
圖1、大腸桿菌DA14781暴露于厄他培南1、2、4和16×MIC，大腸桿菌DA19482暴露于環(huán)丙沙星，從oCelloScope(A)、Bioscreen C(B)和標(biāo)準(zhǔn)時間殺滅實驗(C)獲得的平均細(xì)菌生長曲線0.5、1、2和4×MIC和粘菌素0.25、0.5、1、2和8×MIC和銅綠假單胞菌ATCC 27853暴露于粘菌素0.5、1、2和4×MIC和美羅培南1、2、4和16×麥克風(fēng)。每條線代表不同的抗生素濃度，如圖例所示。(C)中的符號代表實驗中使用的采樣時間，黑色虛線代表檢測限為10 CFU/毫升。
圖2、從oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)顯示示出的細(xì)胞形態(tài)所獲得的圖像。大腸桿菌DA14781用厄他培南（A）DA14781，大腸桿菌DA19482和環(huán)丙沙星（B）和多粘菌素E（C），和銅綠假單胞菌ATCC 27853與粘菌素（D）和美羅培南（E)在0、2、4和24小時。
圖3、從oCelloScope獲得的背景校正吸收(BCA)與通過大腸桿菌DA14781（空心方塊）和DA19482（實心菱形）、銅綠假單胞菌ATCC 27853（空心圓圈）和空白（灰色填充）的活菌計數(shù)獲得的細(xì)菌濃度之間的一致性三角形）。在添加抗生素后1、4、6和24小時。黑色虛線代表10 CFU/mL的檢測限。低于LOD的數(shù)據(jù)繪制為5 CFU/mL。空白樣品的細(xì)菌濃度設(shè)置為0 CFU/mL。
圖4、通過的活菌計數(shù)獲得從BIOSCREEN C中獲得的光密度（OD）和細(xì)菌濃度之間相關(guān)性，大腸桿菌DA14781（空心方塊）和DA19482（實心菱形），銅綠假單胞菌ATCC 27853（空心圓）和空白（灰色填充的三角形），在添加抗生素后1、4、6和24小時。黑色虛線代表10 CFU/mL的檢測限。低于LOD的數(shù)據(jù)繪制為5 CFU/mL。空白樣品的細(xì)菌濃度設(shè)置為0 CFU/mL。
圖5、oCelloScope、Bioscreen C和標(biāo)準(zhǔn)時間消殺方法的量化方法、優(yōu)點和局限性總結(jié)。如表1中總結(jié)的，標(biāo)準(zhǔn)時間殺死實驗可以提供關(guān)于實驗期間初始細(xì)菌殺死的更詳細(xì)信息。此外，由于工作量較大，時間消散是一種更靈敏的檢測耐藥性出現(xiàn)的方法。然而與時間消磨方法相比，自動化方法的勞動密集度較低，并且每天的產(chǎn)能要高得多。oCelloScope系統(tǒng)可以提供比Bioscreen C更多的信息，因為它具有較低的LOD，還可以用于在實驗過程中視覺檢測形態(tài)特征。
總結(jié)
近些年已經(jīng)開發(fā)了許多用于快速評估抗生素活性的自動化方法。這些方法中的大多數(shù)提供了關(guān)于實驗過程中細(xì)菌殺死和生長動態(tài)的有限信息。例如Bioscreen C是基于濁度測量，已用于研究以連續(xù)監(jiān)測細(xì)菌生長。然而這種方法需要高細(xì)菌接種量來檢測光密度(OD)的變化以及與每毫升菌落形成單位(CFU)的相關(guān)性，如活菌計數(shù)確定的那樣，測試得到的數(shù)值是不確定的。最近開發(fā)的一個系統(tǒng)，oCelloScope基于數(shù)字延時顯微鏡和圖像分析，也被提議用于測量實時細(xì)菌生長。使用這種方法，每個時間點的圖像都使用選定的算法同時處理例如，背景校正吸收（BCA）和表面積的分割和提取（SESA）。oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)用于研究暴露于-內(nèi)酰胺抗生素和環(huán)丙沙星時大腸桿菌的細(xì)菌形態(tài)，以及暴露于丙酸時青霉菌的細(xì)菌形態(tài)。oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)具有有效評估抗菌活性的潛力，可用于抗生素的高通量篩選，單獨或與其他藥物聯(lián)合使用。研究發(fā)現(xiàn)與Bioscreen C相比，oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)提供了關(guān)于105至107 CFU/mL范圍內(nèi)的細(xì)菌生長動態(tài)和形態(tài)特征的額外信息。總之oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)非常適合于抗生素體外效果的檢測，特別是在需要檢測大量方案的情況下。
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