探究P2Y2受體在人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞）增殖過(guò)程中的作用
隨著人們生活節(jié)奏加快，子宮頸癌（cervical cancer）在中國(guó)女性群體中的發(fā)病率逐漸上升，已成為常見的婦科疾病之一，其發(fā)病率和死亡率已占世界的三分之一左右［1］。研究發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌與HPV感染、p53和Rb失活、端粒酶激活、抑癌基因表達(dá)失常、癌基因激活和炎性細(xì)胞因子等密切相關(guān)，是多基因改變，多步驟發(fā)生的一類全身性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［2-4］。P2Y2受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族的典型代表，廣泛分布于正常組織中且具有組織特異性［5］。研究證明，P2Y2受體在多種癌癥患者組織及細(xì)胞中均有表達(dá)，其中Kyse-140食管癌細(xì)胞系、T47-D乳腺癌細(xì)胞系及Hela子宮頸癌細(xì)胞系等均可特異性表達(dá)P2Y2受體［6-7］，結(jié)合P2Y2受體其在介導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖，分化和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用，提示P2Y2受體可能參與子宮頸癌病理生理過(guò)程。2-硫代-UTP是P2Y2受體的特異性激動(dòng)劑，其可通過(guò)活化P2Y2受體激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，P2Y2受體活化后也可與其他受體相互作用，從而影響其自身與G蛋白發(fā)生偶聯(lián)的能力［8-9］。P2Y2受體拮抗劑蘇拉明可有效阻斷P2Y2受體功能及其下游活動(dòng)，進(jìn)而抑制P2Y2受體介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)［10］。本研究通過(guò)特異性拮抗劑和激動(dòng)劑處理Hela細(xì)胞，在細(xì)胞水平上探究P2Y2受體在Hela細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用，在研究子宮頸癌新型治療靶點(diǎn)和手段等方面具有重要意義。
實(shí)驗(yàn)材料
人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞，KCB 86019YJ）由中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)提供。DMEM培養(yǎng)基由HyClone公司提供，小牛血清由四季青生物工程材料有限公司提供，2-硫代-UTP和蘇拉明由索萊寶生物科技有限公司提供，TNF-α和IL-6檢測(cè)試劑盒由博士德生物工程有限公司提供，CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒由天根生化科技有限公司提供，山羊抗兔P2Y2多克隆抗體由Abcam公司提供，GAPDH單克隆抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，qPCR試劑盒由TakaRa公司提供，總RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。
實(shí)驗(yàn)分組
細(xì)胞所用培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基（含10%小牛血清和1%青鏈霉素混合液），實(shí)驗(yàn)分為3組，即：正常對(duì)照組、2-硫代-UTP處理組（50μmol／L）和蘇拉明（100μmol／L）處理組，所用藥物均用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，所用細(xì)胞均控制在30代以內(nèi)。
CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性
按照實(shí)驗(yàn)所設(shè)分組，用96孔板接種細(xì)胞，密度約為1×104／mL，每孔100μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，共接種3塊孔板。細(xì)胞貼壁后行藥物干擾，每間隔6h進(jìn)行一次細(xì)胞活性檢測(cè)，檢測(cè)8次，共48h。CCK-8儲(chǔ)存液按1：10的比例DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞處理后更換CCK-8稀釋液，每孔100μL，于37℃培養(yǎng)箱（5%CO2）孵育2h，450nm檢測(cè)每孔的吸光度，以吸光度大小表示各組細(xì)胞活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果與生長(zhǎng)曲線
各處理組細(xì)胞8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活性檢測(cè)結(jié)果如表1所示，根據(jù)表1繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（見圖1）。結(jié)果顯示，2-硫代-UTP處理組細(xì)胞較對(duì)照組生長(zhǎng)速率明顯加快，以第24h時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)速率出現(xiàn)最大值，且達(dá)到平臺(tái)期所用時(shí)間也有所縮短。蘇拉明處理組細(xì)胞生長(zhǎng)速率均顯著低于對(duì)照組和2-硫代-UTP處理組，且未出現(xiàn)細(xì)胞接觸抑制現(xiàn)象。
表1各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果（±s）
討論
子宮頸癌是女性群體高發(fā)腫瘤疾病之一，僅次于乳腺癌，位列女性惡性腫瘤的第二位。中國(guó)是子宮頸癌高危大國(guó)，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。目前，子宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，探索新型有效的治療靶點(diǎn)對(duì)防治子宮頸癌等疾病具有重要意義。P2Y受體家族是一類具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，目前已從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功克隆出8種功能性P2Y受體亞型，I類受體包括P2Y1、P2Y2、P2Y、P2Y、P2Y，II類受體包括P2Y～P2Y［11-12］。
46111214近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，P2Y受體家族尤其是P2Y2受體，在多種癌癥組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，并在癌細(xì)胞的增殖，分化和轉(zhuǎn)移等活動(dòng)中扮演重要角色［13-14］。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果繪制各處理組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，從中可以看出，正常生長(zhǎng)的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”狀，而2-硫代-UTP處理組細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期的斜率大于對(duì)照組，且其到達(dá)平臺(tái)期所用的時(shí)間明顯比對(duì)照組縮短，即2-硫代-UTP可通過(guò)激活P2Y2受體功能促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖。與之相反，經(jīng)蘇拉明處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯減慢，且細(xì)胞未達(dá)到接觸抑制時(shí)即出現(xiàn)平臺(tái)期，表明蘇拉明通過(guò)阻斷P2Y2受體功能可抑制了Hela細(xì)胞活性。
研究發(fā)現(xiàn)，P2Y受體激活后可進(jìn)一步活化不同的G蛋白，進(jìn)而引發(fā)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［15］。P2Y2受體可通過(guò)激活Gq／11或Gi／o等類型的G蛋白，激活PLC途徑，介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2＋和炎性介質(zhì)釋放，進(jìn)而激活下游NF-κB轉(zhuǎn)錄因子及CaMKII，最終產(chǎn)生促增殖效應(yīng)或介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。也有研究認(rèn)為，2-硫代-UTP可通過(guò)P2Y2受體引起APE1／Ref-1活化，或?qū)е率荏w本身過(guò)表達(dá)［17］。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可看出，各處理組細(xì)胞均在第24h時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值，因此我們選擇檢測(cè)第24h時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞P2Y2受體表達(dá)情況。我們通過(guò)qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)確定了在Hela細(xì)胞中可表達(dá)P2Y2受體，且經(jīng)2-硫代-UTP處理后的細(xì)胞中P2Y2受體mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，表明2-硫代-UTP在激活P2Y2受體功能的同時(shí)也可上調(diào)其受體本身的表達(dá)，而蘇拉明處理組中以上指標(biāo)均無(wú)顯著變化。
ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)2-硫代-UTP處理后的細(xì)胞IL-6水平明顯升高，蘇拉明處理組細(xì)胞也觀察到了TNF-α釋放量的增加。結(jié)合IL-6與細(xì)胞活化和增殖相關(guān)，尤其是其可作為生長(zhǎng)因子刺激腫瘤細(xì)胞，特別是骨髓瘤細(xì)胞的增殖和遷移以及TNF-α能顯著殺傷腫瘤細(xì)胞活性［18-19］等研究背景，推斷P2Y2受體對(duì)Hela細(xì)胞活性的影響可能與其介導(dǎo)IL-6或TNF-α等炎性介質(zhì)相關(guān)。
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)P2Y2受體功能激活能促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖，阻斷其受體功能可顯著抑制Hela細(xì)胞活性。這將為研究新型有效的抑癌靶點(diǎn)及探索子宮頸癌潛在的治療手段等方面提供科學(xué)依據(jù)。
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