鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)能力的測(cè)定——材料與方法
在鼠疫疫源地監(jiān)測(cè)中，當(dāng)動(dòng)物鼠疫處于流行末期或靜息期，由于鼠疫菌毒力減弱或完全喪失，不能致動(dòng)物死亡，但存在于動(dòng)物體內(nèi)，由于菌量減少，若按一般常規(guī)培養(yǎng)基分離鼠疫菌比較困難，因此進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)必須要求特別敏感的增菌培養(yǎng)基分離鼠疫菌，而且自然界鼠疫菌一般從自斃動(dòng)物體內(nèi)分離，由于自斃動(dòng)物腐敗，從一個(gè)污染的材料中分離鼠疫耶爾森菌(鼠疫菌)，受變形桿菌、革蘭氏陽(yáng)性菌的影響鼠疫菌分離困難[1]。因此研制及應(yīng)用一種分離鼠疫耶爾森氏菌的選擇培養(yǎng)基，可以提高鼠疫菌的分離率，是野外鼠疫監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)及實(shí)驗(yàn)室研究的關(guān)鍵技術(shù)?，F(xiàn)有鼠疫菌的選擇培養(yǎng)基主要有龍膽紫培養(yǎng)基，在實(shí)際工作中，這2種培養(yǎng)基分離污染材料中的鼠疫菌效果不理想，本研究根據(jù)鼠疫菌培養(yǎng)特性，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入可以刺激鼠疫菌生長(zhǎng)的生化試劑和抑制變形桿菌及革蘭氏陽(yáng)性菌的試劑，研制出2種選擇敏感培養(yǎng)基(1%枸椽酸鈉選擇培養(yǎng)基和4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)菌株在以上2種培養(yǎng)基的生長(zhǎng)測(cè)試，并收集野外材料現(xiàn)場(chǎng)分離，比較2種選擇敏感培養(yǎng)基對(duì)于鼠疫菌的檢出性能和檢測(cè)效果，初步評(píng)價(jià)其應(yīng)用效果。
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1腐敗材料搜集野外動(dòng)物材料(旱獺，犬)共5份，其中1號(hào)和4號(hào)旱獺僅剩股骨殘骸，2號(hào)、3號(hào)旱獺及5號(hào)犬臟器高度腐敗，但仍保留心、肝、脾、肺，各臟器均有不同程度潰爛。
1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株
耶爾森氏菌屬的鼠疫疫苗株(EV菌株)、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及野外腐敗材料常見雜菌:變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌均由鼠疫菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。
1.1.3儀器設(shè)備
丹麥Biosense微生物全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器，英國(guó)Symbioses公司;低氧細(xì)胞工作站H45 HEPA，英國(guó)DWS公司;Ⅱ級(jí)B2型生物安全柜，賀利氏HERAsafe生物，德國(guó)Heraus公司，中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管(批號(hào)2018-1)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。
1.2方法
1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備
赫氏瓊脂，含牛肉消化液200 m L，水800 m L，蛋白胨10 g，瓊脂14 g，乳糖10 g，調(diào)p H7.2～p H7.4。對(duì)照培養(yǎng)基:1%溶血赫氏培養(yǎng)基，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃左右，冷卻后加入10%脫纖維兔溶血，混勻后傾注平皿。
1.2.2龍膽紫培養(yǎng)基
龍膽紫0.1 g加無(wú)水乙醇2 m L溶解后，加蒸餾水至90 m L，121℃高壓滅菌30 min高壓滅菌后冷卻至50℃加入新鮮血液10 m L，混合后取10 m L加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 L，制備成含有1/10萬(wàn)龍膽紫溶血瓊脂培養(yǎng)基。
1.2.3 1號(hào)培養(yǎng)基
(4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基)十二烷基硫酸鈉4 g，紅霉素0.5 mg，膽鹽3號(hào)5 g，阿莫西林12.5 mg，甘露醇1 g，中性紅0.03 g)。2號(hào)培養(yǎng)基(1%枸櫞酸鈉選擇培養(yǎng)基)去氧膽酸鈉1 g，枸櫞酸鈉1 g，枸櫞酸鐵1 g。將以上2種選擇培養(yǎng)基試劑分別經(jīng)121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃的1000 m L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，即組成不同的選擇培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)能力的測(cè)定
將鼠疫EV菌株28℃培養(yǎng)48 h，制成濃度為1000個(gè)菌/m L菌懸液，取0.1 m L分別接種以上3種選擇培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基，置于28℃溫箱培養(yǎng)24～48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，觀察記錄平板單個(gè)菌落生長(zhǎng)情況。
1.2.5 3種培養(yǎng)基敏感性及特異性檢測(cè)
將各實(shí)驗(yàn)菌株(耶爾森氏菌屬的鼠疫EV菌株、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌)、野外腐敗材料常見雜菌(變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌)制成菌懸液，根據(jù)比濁管稀釋成1000個(gè)菌/m L菌懸液，取0.1 m L涂布到4種培養(yǎng)基上，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。
1.2.6腐敗動(dòng)物材料
鼠疫菌分離培養(yǎng)采集腐敗動(dòng)物臟器材料(旱獺和犬的股骨、肝、脾)，分別接種3種選擇培養(yǎng)基，28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h，觀察鼠疫菌生長(zhǎng)及分離情況。在各選擇培養(yǎng)基上挑選可疑鼠疫菌菌落經(jīng)鼠疫噬菌體實(shí)驗(yàn)確診為鼠疫菌，以上實(shí)驗(yàn)均以1%溶血赫氏培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基。
1.2.7菌落計(jì)數(shù)參考《GB 4789.2—2016，菌落總數(shù)測(cè)定》。
相關(guān)新聞推薦
1、腸道細(xì)菌大腸桿菌與脆弱類桿菌聯(lián)合，或能導(dǎo)致結(jié)直腸癌癥發(fā)生
2、10種有機(jī)物對(duì)氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長(zhǎng)、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（三）
3、內(nèi)生真菌對(duì)木本植物生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制及響應(yīng)過(guò)程
4、香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)能力、產(chǎn)胞外蛋白酶和生物被膜能力影響（一）