大腸埃希菌的菌落數(shù)范圍、貯藏條件、活性及性狀的穩(wěn)定性【實(shí)驗(yàn)】
摘要：大腸埃希菌在4°中貯藏，其作為實(shí)驗(yàn)菌的活性。連續(xù)31天進(jìn)行大腸埃希菌計(jì)數(shù)和特征實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而驗(yàn)證其數(shù)量及性狀的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在連續(xù)31天的實(shí)驗(yàn)中，大腸埃希菌的菌落數(shù)范圍在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml，且菌落大小、形態(tài)特征、指示反應(yīng)等情況均體現(xiàn)出該菌種應(yīng)有特性。實(shí)驗(yàn)證明，在4°冰柜貯藏條件下，大腸埃希菌能夠作為對(duì)照菌進(jìn)行控制菌檢查法實(shí)驗(yàn)。
依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版，非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中的控制菌檢查法，需進(jìn)行陽性對(duì)照試驗(yàn)，每次試驗(yàn)均需要加入不大于100cfu的對(duì)照菌。依據(jù)藥典指導(dǎo)原則，菌種可采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30℃）等保存方法。使用以上方法保存菌種，則需在每次實(shí)驗(yàn)前都要進(jìn)行菌種活化和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而配制不大于100cfu的加菌量。本公司藥品均進(jìn)行微生物限度檢查，其中含有大腸埃希菌項(xiàng)目。為提高檢驗(yàn)效率，尋找適宜的菌種貯藏方法，同時(shí)結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，將大腸埃希菌經(jīng)復(fù)蘇后接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，24h菌種活化后，4°C冰柜里貯藏。隨后每日進(jìn)行菌種數(shù)量及性狀驗(yàn)證，為進(jìn)行大腸埃希菌的貯藏提供有益的科學(xué)探討。
1材料與方法
1.1儀器與材料
BPX-272型電熱恒溫培養(yǎng)箱;YSQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器;生物安全柜;大腸埃希菌[CMCC（B）44102]購自中國食品藥品檢定研究院;實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1菌液制備：復(fù)蘇后的大腸埃希菌菌種（不超過5代）移至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置培養(yǎng)箱中30～35°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)后貯藏至4°C冰柜。
1.2.2菌種計(jì)數(shù)：取1ml菌液用pH7.0蛋白胨緩沖液逐級(jí)稀釋至10-10，取各級(jí)稀釋菌懸液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45°C熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。30～35°C培養(yǎng)24h，然后用μCount3D微生物計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。
1.2.3性狀驗(yàn)證：10-8稀釋級(jí)菌液大腸埃希菌接種于麥康凱液體培養(yǎng)基（42～44°C培養(yǎng)24h）和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（30～35°C培養(yǎng)24h）中，觀察培養(yǎng)基上大腸埃希菌生長情況。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1菌種計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表1可以看出，大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續(xù)31天的菌落數(shù)范圍在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml之間。
2.2性狀驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表2可以看出，大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續(xù)31天取菌液量均不大于100cfu，加入麥康凱液體培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基體現(xiàn)的菌落大小、形態(tài)特征、指示反應(yīng)等情況均體現(xiàn)出大腸埃希菌應(yīng)有特性（+表示）。
綜上，將大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續(xù)31天進(jìn)行計(jì)數(shù)和性狀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，取10-8稀釋級(jí)菌液，每ml菌液量均不大于100cfu，這可用于大腸埃希菌檢測陽性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量，無需每次進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，每ml10-8稀釋級(jí)菌液也能夠表現(xiàn)出大腸埃希菌應(yīng)有特性。由此證明，每次進(jìn)行大腸埃希菌實(shí)驗(yàn)，可直接用貯藏菌液稀釋至10-8，取1ml作為陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的加菌量。
3討論
藥品微生物限度檢查是控制藥品質(zhì)量的一個(gè)重要檢查項(xiàng)目，其中控制菌檢查是必須進(jìn)行的檢驗(yàn)項(xiàng)目。控制菌檢查過程中，需要添加不大于100cfu陽性菌進(jìn)行陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。按照冷凍法活化新鮮菌種，進(jìn)而制備試驗(yàn)菌，其工作量較大，周期較長。現(xiàn)采用4°C冰柜貯藏大腸埃希菌菌液，每次可以直接進(jìn)行稀釋使用，提高工作效率，同時(shí)也可保障檢驗(yàn)的順利進(jìn)行。本文只對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他菌種（銅綠假單胞菌、沙門菌等）未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，故是否能應(yīng)用于所有控制菌實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步研究。
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